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HTRF (H/M) RAB10 TOTAL KIT - 500 PTS HTRF总大鼠肉瘤相关蛋白10检测试剂盒，500测试

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概述

RAS 相关蛋白 Rab10（RAB10）属于小 GTP 酶家族中的 RAS 超家族。Rab10 是细胞内膜转运的关键调控因子，可调控膜结合细胞器与囊泡的生物发生、转运、锚定及融合过程。富含亮氨酸重复序列激酶 2（LRRK2）介导的磷酸化作用，可能导致 Rab10 调控的内溶酶体转运通路功能异常，进而参与神经退行性疾病的发生。Rab10 与阿尔茨海默病及帕金森病相关。

工作原理

总 Rab10 均相时间分辨荧光（HTRF）检测原理

总 Rab10 检测可对细胞裂解液中 Rab10 的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

总 Rab10 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 Rab10 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 Rab10 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 Rab10 蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估 Rab10 蛋白的表达水平。

phospho-how-it-works-rab10-total-assay-principle（图示：总 Rab10 检测原理）

总 Rab10 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入总 Rab10 均相时间分辨荧光检测试剂。

该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-rab10-total-assay-protocol-01（图示：总 Rab10 双板检测方案）

总 Rab10 单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测总 Rab10 时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。

该方案专为高通量筛选（HTS）设计，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-how-it-works-rab10-total-assay-protocol-02（图示：总 Rab10 单板检测方案）

检测验证

A549 和 Raw264.7 细胞系中 Rab10 苏氨酸 73（Thr73）位点磷酸化的抑制检测

将 A549 细胞和 Raw264.7 细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜。随后用浓度递增的 MLi-2 处理细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 1.5 小时，接着用 100 微摩尔（µM）的氯喹（chloroquine）刺激细胞 3 小时。

细胞裂解后，取 16 微升（µL）裂解液转移至 384 孔小体积（sv）白色微孔板，加入 4 微升磷酸化（Thr73）Rab10 均相时间分辨荧光检测试剂，以检测磷酸化蛋白水平。同时，取 4 微升裂解液（补充 8 微升裂解缓冲液）转移至另一微孔板，先加入 2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 A、2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 B，再加入 4 微升总 Rab10 检测试剂，以检测总 Rab10 蛋白水平。在室温下孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：MLi-2 处理以剂量依赖方式抑制 Rab10 Thr73 位点的磷酸化，而 Rab10 的表达水平保持稳定。

assay-validation-rab10-total-pharmaco-1-1（图示：总 Rab10 药物验证 1-1）

assay-validation-rab10-total-pharmaco-1-2（图示：总 Rab10 药物验证 1-2）

小干扰 RNA（siRNA）介导的总 Rab10 下调检测

将 A549 细胞以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，培养 24 小时。随后用 Rab10 特异性小干扰 RNA 及阴性对照小干扰 RNA 转染细胞。孵育 48 小时后裂解细胞，取 4 微升裂解液（补充 8 微升裂解缓冲液）转移至 384 孔小体积白色微孔板，先加入 2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 A、2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 B，再加入 4 微升总 Rab10 均相时间分辨荧光检测抗体。另外，取 4 微升裂解液（补充 12 微升 11 号稀释液）转移至该微孔板，使用 GAPDH 内参细胞检测试剂盒（64GAPDHPET/G/H）监测甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH）水平。孵育过夜后，记录两种试剂盒的均相时间分辨荧光信号。

结果显示：与阴性对照小干扰 RNA 转染组相比，Rab10 小干扰 RNA 转染组的细胞信号降低 74%；在所有测试条件下，所检测的 GAPDH 水平均保持不变。该数据表明，总 Rab10 均相时间分辨荧光检测对 Rab10 蛋白的检测具有特异性。

assay-validation-rab10-total-pharmaco-2-1（图示：总 Rab10 药物验证 2-1）

assay-validation-rab10-total-pharmaco-2-2（图示：总 Rab10 药物验证 2-2）

人源和鼠源细胞系中的总 Rab10 检测

将 A549 细胞、1321-N1 细胞和 Raw264.7 细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用补充后的裂解缓冲液裂解细胞，取 4 微升裂解液（补充 8 微升裂解缓冲液）转移至 384 孔小体积白色微孔板，先加入 2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 A、2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 B，再加入 4 微升总 Rab10 均相时间分辨荧光检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：总 Rab10 均相时间分辨荧光检测可在表达不同水平 Rab10 蛋白的多种细胞模型中有效检测 Rab10。

assay-validation-rab10-total-pharmaco-3（图示：总 Rab10 药物验证 3）

总 Rab10 均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的比较

将 A549 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。孵育 48 小时后，用 500 微摩尔氯喹刺激细胞 5 小时，随后加入 3 毫升补充后的 3 号裂解缓冲液（1 倍浓度，1X），在室温（RT）下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 12 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，先加入 2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 A、2 微升均相时间分辨荧光磷酸化与总蛋白激活试剂 B，再加入 4 微升总 Rab10 均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液，通过蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法进行平行对比检测。

结果显示：蛋白质印迹法与均相时间分辨荧光法的平行对比表明，至少在此实验条件下，总 Rab10 均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 32 倍。

assay-validation-rab10-total-pharmaco-4（图示：总 Rab10 药物验证 4）

简化通路

简化的 Rab10 信号通路

富含亮氨酸重复序列激酶 2（LRRK2）是常染色体显性遗传帕金森病的主要致病基因，作为一种蛋白激酶，它可磷酸化包括 Rab10 在内的部分 Rab GTP 酶。Rab29 可介导 LRRK2 向细胞器膜的募集，并增强 LRRK2 的酶活性（通过 Ser1292 自身磷酸化监测）。LRRK2 可诱导 Rab10 的 Thr73 位点磷酸化，而磷酸化的 Rab10 进而调控纤毛发生、囊泡转运、膜转运及融合过程。

phospho-pathway-rab10-total（图示：总 Rab10 信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域（Application）：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
品牌（Brand）：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式（Detection Modality）：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：3 号裂解缓冲液（Lysis Buffer 3）
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）、小鼠（Mouse）
技术平台（Technology）：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格（Unit Size）：500 次检测（500 assay points）

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货号：64RAB10TPEG

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