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HTRF RB TOTAL KIT - 500 PTS 总RB试剂盒–500测试

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概述

基于细胞的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）总蛋白检测（Total-Rb cell-based assay）旨在监测 Rb 蛋白的表达水平，包括磷酸化和非磷酸化两种形式。该检测使用的缓冲液与我们的 Rb 磷酸化检测试剂盒（Phospho-Rb kit）一致，能够对同一份样本中的磷酸化蛋白和总蛋白进行分析，从而更清晰地解读细胞周期蛋白 - 细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-Cdk）通路的活性。由于 Rb 在细胞周期进程中发挥核心作用，它已成为肿瘤疾病研究中的重要靶点。

工作原理

Rb 总蛋白检测原理

Rb 总蛋白检测可对细胞裂解液中 Rb 蛋白的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

Rb 总蛋白检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 Rb 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 Rb 蛋白时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 Rb 蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估 Rb 蛋白的表达水平。

phospho-how-it-works-total-rb-assay-principle（图示：Rb 总蛋白检测原理）

Rb 总蛋白双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入 Rb 总蛋白均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-total-rb-2-plate-assay-protocol（图示：Rb 总蛋白双板检测方案）

Rb 总蛋白单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测 Rb 总蛋白时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-how-it-works-total-rb-1-plate-assay-protocol（图示：Rb 总蛋白单板检测方案）

检测验证

在 HCT-116 细胞中，帕博西尼（Palbociclib）可有效抑制 Rb 磷酸化并轻微降低其总蛋白量

将 HCT-116 细胞用 50 微升（µL）完全培养基，以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育。6 小时后，加入浓度递增的帕博西尼（额外添加 50 微升），处理 19 小时。

移除培养基后，加入 50 微升补充后的裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡裂解 30 分钟；取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升预混合的均相时间分辨荧光 Rb 磷酸化（丝氨酸 780 位点）、Rb 磷酸化（丝氨酸 807/811 位点）或 Rb 总蛋白检测试剂。孵育 4 小时后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4 和 CDK6）抑制剂帕博西尼，会导致 Rb 丝氨酸 780 位点和丝氨酸 807/811 位点的磷酸化水平显著降低，同时 Rb 总蛋白量也会下降（该结果与 Liu 等人 2017 年发表在《公共科学图书馆》（Plos）期刊的研究一致）。

assay-validation-rb-total-1（图示：Rb 总蛋白检测验证 1）

人源 HCT116 细胞中 Rb 总蛋白均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将人源 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中，于 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。当细胞融合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，最终加入 Rb 总蛋白细胞检测试剂盒试剂。

平行对比结果显示：Rb 总蛋白均相时间分辨荧光检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 27 倍。

assay-validation-rb-total-2（图示：Rb 总蛋白检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）

分子量为 110 千道尔顿（kDa）的视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130 蛋白。

Rb 作为肿瘤抑制因子，可调控细胞周期进程。当 Rb 发生失活突变时，会引发视网膜母细胞瘤 —— 此时视网膜细胞无法正常更新，且会暴露于高剂量致突变紫外线辐射下。

在无有丝分裂信号时，具有活性的去磷酸化 Rb 会结合并抑制 E2F 转录因子，而 E2F 是细胞进入 S 期（DNA 合成期）所必需的。通过维持 E2F 的失活状态，Rb 可使细胞停留在 G1 期，阻止细胞周期继续推进。

当存在有丝分裂信号时，Rb 会被细胞周期蛋白 D - 细胞周期蛋白依赖性激酶 4/6（cyclin D-CDK4/6）依次磷酸化，随后再被细胞周期蛋白 E - 细胞周期蛋白依赖性激酶 2（cyclin E-CDK2）磷酸化，最终失活。这一磷酸化过程会促使 E2F 转录因子释放。

最终，E2F 会激活多种基因的转录，如细胞周期蛋白（cyclins）、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）、胸苷激酶（Thymidine kinase）和增殖细胞核抗原（PCNA）等 —— 这些基因在 DNA 合成、复制及细胞分裂中发挥关键作用。

phospho-pathway-rb-total-63adk106peg（图示：Rb 总蛋白相关细胞周期信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域（Application）：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
品牌（Brand）：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式（Detection Modality）：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）
技术平台（Technology）：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域（Therapeutic Area）：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格（Unit Size）：500 次检测（500 assay points）

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货号：64RBTPEG

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