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HTRF RET TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

RET 总蛋白细胞检测（Total-RET cellular assay）可监测 RET 总蛋白（包括短亚型和长亚型），并可作为 RET 磷酸化（泛特异性）检测试剂盒（Phospho-RET (pan) kit）的归一化检测工具。该试剂盒与 RET 磷酸化检测试剂盒的缓冲液兼容，因此同一份裂解液可用于分析磷酸化蛋白和总蛋白群体。

原癌基因 RET（转染重排基因，Rearranged during Transfection），又称 c-Ret，是一种受体酪氨酸激酶，主要以两种亚型存在，分别含 1072 个和 1114 个氨基酸。RET 可被胶质细胞源性神经营养因子家族配体（GFL）激活，激活后会发生二聚化，并在细胞内酪氨酸残基上发生自身磷酸化。RET 对神经系统及其他多种组织的发育至关重要。在多种人类癌症中已检测到 RET 基因改变，因此研发高选择性、高效能的 RET 激酶抑制剂对于治疗 RET 基因改变相关癌症具有重要意义。近年来，RET 还被发现与神经退行性疾病相关。

工作原理

RET 总蛋白检测原理

均相时间分辨荧光（HTRF）RET 总蛋白检测可对细胞裂解液中 RET 蛋白的表达水平进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

RET 总蛋白检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 RET 蛋白上的特定表位具有高特异性。当细胞提取物中存在 RET 蛋白时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 RET 蛋白的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估 RET 蛋白的表达水平。

phospho-how-it-works-ret-total-assay-principle（图示：RET 总蛋白检测原理）

RET 总蛋白双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入 RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-ret-total-assay-protocol-1（图示：RET 总蛋白双板检测方案）

RET 总蛋白单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测 RET 总蛋白时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-how-it-works-ret-total-assay-protocol-2（图示：RET 总蛋白单板检测方案）

检测验证

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的诱导

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以每孔 50,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的过钒酸盐（Pervanadate）处理细胞 15 分钟，实验分为两组：一组不加小鼠胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），另一组加入 100 纳克 / 毫升（ng/mL）的小鼠 GDNF。处理结束后，加入 50 微升（µL）补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：在未加入过钒酸盐的情况下，可观察到 GDNF 诱导的 RET 磷酸化；加入 6.25 微摩尔（µM）和 12.5 微摩尔过钒酸盐（可抑制酪氨酸去磷酸化）后，检测效果显著提升；单独使用 50 微摩尔过钒酸盐时，RET 磷酸化水平达到最高。

RET 总蛋白检测结果显示，在所有实验条件下，RET 总蛋白水平保持稳定，这表明高剂量过钒酸盐未导致细胞脱落。

assay-validation-ret-total-1（图示：RET 总蛋白检测验证 1）
assay-validation-ret-total-2（图示：RET 总蛋白检测验证 2）

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼（Pralsetinib）处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无影响。

assay-validation-ret-total-3（图示：RET 总蛋白检测验证 3）

人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼和塞普替尼（Selpercatinib）处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：两种 RET 激酶抑制剂均以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无影响。

assay-validation-ret-total-4（图示：RET 总蛋白检测验证 4）
assay-validation-ret-total-5（图示：RET 总蛋白检测验证 5）

人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 中 RET 磷酸化的抑制

将人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 以每孔 50,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。用浓度递增的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 微摩尔过钒酸盐。加入 50 微升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光 RET 磷酸化（泛特异性）或 RET 总蛋白检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果符合预期：RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，但对 RET 受体的表达水平无显著影响。

assay-validation-ret-total-6（图示：RET 总蛋白检测验证 6）

RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将 SH-SY5Y 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% 二氧化碳。用 100 微摩尔过钒酸盐处理细胞 30 分钟，随后加入 3 毫升补充后的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升 RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液用于均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的平行对比。

结果显示：使用 RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测时，每孔 3,400 个细胞即可检测到显著信号；而使用蛋白质印迹法时，需每孔 27,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，RET 总蛋白均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

assay-validation-ret-total-7（图示：RET 总蛋白检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

RET 信号通路

RET 可被胶质细胞源性神经营养因子家族配体（GFL）激活，该家族配体包括胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、神经营养素（NRTN）、艺术 emin（ARTN）和 Persephin（PSPN）。配体与 GDNF 家族受体 α 共受体（GFRα1/2/3/4）结合后，会触发其与 RET 形成复合物，进而导致 RET 发生二聚化，并在细胞内多个酪氨酸残基上发生自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基可作为多种衔接蛋白的结合位点，这些衔接蛋白会激活下游信号通路（如 MAPK、PI3K/AKT、STAT3 等），而这些通路对于细胞存活、分化、增殖和迁移至关重要。

phospho-pathway-ret-total（图示：RET 总蛋白相关信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域（Application）：细胞信号通路研究（Cell Signaling）
自动化兼容性（Automation Compatible）：是（Yes）
品牌（Brand）：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式（Detection Modality）：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 µL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）、小鼠（Mouse）
技术平台（Technology）：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域（Therapeutic Area）：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格（Unit Size）：500 次检测（500 assay points）

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