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HTRF RET TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 RET 细胞检测可监测总 RET（短异构体和长异构体），并可与磷酸化 RET（泛）试剂盒配合用作归一化检测。该试剂盒与磷酸化 RET 试剂盒的缓冲液兼容，因此可使用相同的裂解物分析磷酸化蛋白群体和总蛋白群体。

原癌基因 RET（转染重排基因），也称为 c-Ret，是一种受体酪氨酸激酶，主要表达为两种异构体，分别含 1072 个和 1114 个氨基酸。胶质细胞系源性神经营养因子家族配体（GFL）激活 RET 后，会使其发生二聚化并在细胞内酪氨酸残基上发生自磷酸化。RET 是神经系统和其他多种组织发育所必需的。在众多人类癌症中已检测到 RET 的改变。因此，研发高选择性和高效的 RET 激酶抑制剂对于治疗 RET 改变相关癌症具有重要意义。最近，RET 还被发现与神经退行性变有关。

工作原理

总 RET 检测原理

HTRF 总 RET 检测可定量细胞裂解物中 RET 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 RET 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 RET 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的表达水平。

总 RET 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 RET HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 RET 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 RET 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的诱导

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用不同浓度的过钒酸盐处理细胞 15 分钟，处理过程中不加或加入 100 ng/mL 的小鼠 GDNF。处理后，用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在不含过钒酸盐的情况下，可观察到 GDNF 诱导的 RET 磷酸化；在含 6.25 µM 和 12.5 µM 过钒酸盐（可防止酪氨酸去磷酸化）的情况下，检测效果更佳。单独使用 50 µM 过钒酸盐时，可获得最高水平的磷酸化 RET。

总 RET 检测显示，在所有实验条件下总 RET 水平均保持恒定，这证实高剂量过钒酸盐不会导致细胞脱落。

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用不同剂量的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 µM 过钒酸盐。用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如预期所示，RET 激酶抑制剂普拉替尼诱导 RET 磷酸化呈剂量依赖性降低，且对受体的表达水平无影响。

人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用不同剂量的普拉替尼和塞尔帕替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 µM 过钒酸盐。用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如预期所示，两种 RET 激酶抑制剂均诱导 RET 磷酸化呈剂量依赖性降低，且对受体的表达水平无影响。

人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 中 RET 磷酸化的抑制

将人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用不同剂量的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 µM 过钒酸盐。用 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。检测时，将 16 µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如预期所示，RET 激酶抑制剂普拉替尼诱导 RET 磷酸化呈剂量依赖性降低，且对受体的表达水平无显著影响。

HTRF 总 RET 检测与蛋白质印迹法的比较

将 SH-SY5Y 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养 48 小时（37°C、5% CO₂）。用 100 µM 过钒酸盐处理细胞 30 分钟，然后用 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 RET 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 总 RET 检测时，3,400 个细胞 / 孔就足以检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法则需要 27,000 个细胞才能获得最低的化学发光信号。因此，在这些条件下，HTRF 总 RET 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

RET 信号通路
RET 被胶质细胞系源性神经营养因子家族配体（GFL）激活，这些配体包括 GDNF（胶质细胞系源性神经营养因子）、NRTN（神经调节蛋白）、ARTN（艺术 emin）和 PSPN（persephin）。配体与 GDNF 家族受体 -α 共受体（GFRα1/2/3/4）结合，触发与 RET 形成复合物，导致 RET 二聚化并在多个细胞内酪氨酸上发生自磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基作为各种衔接蛋白的停靠位点，这些衔接蛋白可诱导下游信号通路（MAPK、PI3K/AKT、STAT3 等）的激活，而这些通路是细胞存活、分化、增殖和迁移所必需的。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64RETTPEY

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