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HTRF RET P-PAN KIT - 50K PTS

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概述

基于细胞的 HTRF 磷酸化 RET（泛）检测可便捷、准确地检测酪氨酸残基上的磷酸化 RET。该检测可同时测量 RET 的短异构体和长异构体。

原癌基因 RET（转染重排基因），也称为 c-Ret，是一种受体酪氨酸激酶，主要表达为两种异构体，分别含 1072 个和 1114 个氨基酸。神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体（GFL）激活 RET 后，会使其发生二聚化，并在细胞内的酪氨酸残基上发生自身磷酸化。RET 是神经系统和其他多种组织发育所必需的。在多种人类癌症中已检测到 RET 的改变，因此开发高选择性和高效的 RET 激酶抑制剂对于治疗 RET 改变的癌症具有重要意义。最近，RET 还被发现与神经退行性变有关。

工作原理

磷酸化 RET（泛）检测原理

磷酸化 RET（泛）检测用于测量酪氨酸磷酸化后的 RET。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合磷酸化酪氨酸残基，第二种抗体则能特异性识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 RET（泛）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入 HTRF 磷酸化 RET（泛）检测试剂。通过该方案可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 RET（泛）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 RET（泛）时，可在单个培养板中完成细胞培养、刺激和裂解等所有步骤，无需洗涤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的诱导

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 接种到 96 孔培养处理板中，每孔 50,000 个细胞，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。用不同浓度的过钒酸盐处理细胞 15 分钟，处理过程中分为不加小鼠 GDNF 和加入 100 ng/mL 小鼠 GDNF 两种情况。处理后，加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。检测时，将 16 µL 细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

在不含过钒酸盐的情况下，可观察到 GDNF 诱导的 RET 磷酸化；在含 6.25 µM 和 12.5 µM 过钒酸盐（可防止酪氨酸去磷酸化）的情况下，检测效果更好。单独使用 50 µM 过钒酸盐时，可获得最高水平的磷酸化 RET。

总 RET 检测显示，在所有实验条件下总 RET 水平保持恒定，这表明高剂量的过钒酸盐不会导致细胞脱落。

小鼠神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将小鼠神经母细胞瘤细胞系 Neuro-2a 接种到 96 孔培养处理板中，每孔 100,000 个细胞，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。用不同剂量的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 µM 过钒酸盐。加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。检测时，将 16 µL 细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，且对受体的表达水平无影响。

人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中 RET 磷酸化的抑制

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 接种到 96 孔培养处理板中，每孔 100,000 个细胞，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。用不同剂量的普拉替尼和塞尔帕替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 µM 过钒酸盐。加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。检测时，将 16 µL 细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，两种 RET 激酶抑制剂均以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，且对受体的表达水平无影响。

人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 中 RET 磷酸化的抑制

将人肺腺癌细胞系 LC-2/ad 接种到 96 孔培养处理板中，每孔 50,000 个细胞，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。用不同剂量的普拉替尼处理细胞 2 小时，在处理结束前 30 分钟加入 100 µM 过钒酸盐。加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。检测时，将 16 µL 细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 RET（泛）或总 RET 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，RET 激酶抑制剂普拉替尼以剂量依赖性方式降低 RET 磷酸化水平，且对受体的表达水平无显著影响。

简化通路

RET 信号通路

RET 由神经胶质细胞系衍生的神经营养因子家族配体（GFL）激活，这些配体包括 GDNF（胶质细胞系衍生的神经营养因子）、NRTN（神经调节蛋白）、ARTN（艺术 emin）和 PSPN（persephin）。配体与 GDNF 家族受体 -α 共受体（GFRα1/2/3/4）结合后，会触发与 RET 形成复合物，进而导致 RET 二聚化和多个细胞内酪氨酸的自身磷酸化。磷酸化的酪氨酸残基可作为多种衔接蛋白的结合位点，这些衔接蛋白会诱导下游信号通路（MAPK、PI3K/AKT、STAT3 等）的激活，而这些通路对于细胞存活、分化、增殖和迁移至关重要。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：
- 裂解缓冲液 1
- 裂解缓冲液 2
- 裂解缓冲液 3
- 裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64RETYPEY

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