当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF RIPK1 P-S166 KIT - 10K PTS

HTRF RIPK1 P-S166 KIT - 10K PTS

分享给好友

下载产品资料

rvty_ls_manual_64RIPK1S1PEG-64RIPK1S1PEH

下载SDS

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

这款基于细胞的均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂盒，可便捷且准确地检测丝氨酸 166 位点磷酸化的受体相互作用丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 1（RIPK1，又称 RIP1 或 RIP）。RIPK1 是细胞凋亡、坏死性凋亡（程序性坏死）以及肿瘤坏死因子受体 1（TNFR1）等受体介导的炎症通路的关键调控因子。丝氨酸 166 位点的自身磷酸化被视为 RIPK3/MLKL 依赖性坏死性凋亡启动的生物标志物。

坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡通路，也被称为 “炎症性细胞死亡”，与多种疾病密切相关，包括炎症性疾病、神经退行性疾病以及癌症，因此已成为制药行业重要的药物靶点。相关治疗策略主要是研发特异性小分子激酶抑制剂，如知名的坏死抑制素 - 1（Necrostatin-1）和坏死抑制素 - 1s（Necrostatin-1s）。

工作原理

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测原理

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测可对丝氨酸 166 位点发生磷酸化的 RIPK1 进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全微孔板检测模式，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由这两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且可通过 “免洗涤” 检测模式评估蛋白质的磷酸化状态。

phospho-how-it-works-ripk1-phospho-s166-assay-principle（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测原理）

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板后，加入磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）均相时间分辨荧光检测试剂。该方案可实现对细胞存活率和融合度的监测。

phospho-how-it-works-ripk1-phospho-s166-assay-protocol-1（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）双板检测方案）

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光试剂检测磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）时，可在同一块用于细胞培养、刺激和裂解的微孔板中完成检测，无需洗涤步骤。该专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

ripk1-phospho-s166-assay-protocol-2（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）单板检测方案）

检测验证

RT-112/84 细胞中 RIPK1 激酶活性的调控

将人膀胱癌细胞系 RT-112/84 以每孔 200,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜。

RIPK1 激活实验：先用 25 微摩尔（µM）泛半胱天冬酶抑制剂 Z-VAD 预处理细胞 30 分钟，随后同时加入 100 纳摩尔（nM）的 cIAP1/2 抑制剂 SM-164 和不同浓度的人肿瘤坏死因子 -α（TNF-α），处理 6 小时。
RIPK1 抑制实验：先用 25 微摩尔 Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，随后加入浓度递增的坏死抑制素 - 1s；10 分钟后，加入含 100 纳克 / 毫升（ng/mL）TNF-α 和 100 纳摩尔 SM-164 的预混液，处理 6 小时。

处理结束后，加入 50 微升（µL）补充后的 1 号裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）或总 RIPK1 检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：在分别阻断细胞存活（SM-164）和凋亡（Z-VAD）的条件下，TNF-α 以剂量依赖性方式诱导 RIPK1 丝氨酸 166 位点的自身磷酸化，表明坏死性凋亡通路被激活。与文献（1,2）一致，总 RIPK1 水平呈反向调控 —— 这是因为 RIPK1 与其他坏死性凋亡相关蛋白结合形成 “复合物 IIb”，并组装成高度不溶性结构，留存于细胞裂解液的不溶性组分中。

符合预期的是，RIPK1 抑制剂坏死抑制素 - 1s 通过阻断 RIPK1 的自身磷酸化，可抑制 TNF-α 诱导的坏死性凋亡启动。

在上述两种实验中，还对 α- 微管蛋白（alpha-tubulin）水平进行了监测。结果显示，这种管家蛋白的水平未发生变化，表明磷酸化 RIPK1 和总 RIPK1 的水平变化是由药物处理引起，而非坏死性凋亡晚期可能出现的细胞脱落所致。

参考文献：1. Zhu et al. Cell Death and Disease (2018) 9:500；2. Lee et al. Cell Death and Disease (2019) 10:923

assay-validation-ripk1-phospho-s166-1（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测验证 1）
assay-validation-ripk1-phospho-s166-2（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测验证 2）

利用 RIPK1 抑制剂抑制 HT-29 细胞中坏死性凋亡的激活

将人结肠癌细胞系 HT-29 以每孔 100,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。先用 25 微摩尔 Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，随后加入浓度递增的坏死抑制素 - 1 或坏死抑制素 - 1s；10 分钟后，加入含 100 纳克 / 毫升 TNF-α 和 100 纳摩尔 SM-164 的预混液，处理 6 小时。

处理结束后，加入 50 微升补充后的 1 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）或总 RIPK1 检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：RIPK1 抑制剂坏死抑制素 - 1 及其类似物坏死抑制素 - 1s，均以剂量依赖性方式降低 RIPK1 丝氨酸 166 位点的自身磷酸化水平，同时以剂量依赖性方式提高细胞裂解液可溶性组分中的总 RIPK1 水平。符合预期的是，基于磷酸化 RIPK1 和总 RIPK1 的半数抑制浓度（IC50）及半数有效浓度（EC50）值，坏死抑制素 - 1s 的效能比原始小分子坏死抑制素 - 1 高约 3 倍。

assay-validation-ripk1-phospho-s166-3（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测验证 3）
assay-validation-ripk1-phospho-s166-4（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测验证 4）

利用坏死抑制素 - 1s 抑制 SH-SY5Y 细胞中 RIPK1 激酶活性

将人神经母细胞瘤细胞系 SH-SY5Y 以每孔 200,000 个细胞的密度，用完全培养基接种到 96 孔培养处理板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。先用 25 微摩尔 Z-VAD 预处理细胞 20 分钟，随后加入浓度递增的坏死抑制素 - 1s；10 分钟后，加入含 100 纳克 / 毫升 TNF-α 和 100 纳摩尔 SM-164 的预混液，处理 6 小时。

处理结束后，加入 25 微升补充后的 1 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。检测阶段，取 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升均相时间分辨荧光磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）或总 RIPK1 检测试剂。孵育过夜后，记录均相时间分辨荧光信号。

结果显示：坏死抑制素 - 1s 同样能抑制神经细胞中坏死性凋亡通路的启动，表现为 RIPK1 丝氨酸 166 位点的自身磷酸化受到抑制。在该细胞系模型中，未观察到总 RIPK1 水平的变化。

assay-validation-ripk1-phospho-s166-5（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测验证 5）

磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的比较

将人结肠癌细胞系 HT-29 在 T175 培养瓶中用完全培养基培养 48 小时，培养条件为 37°C、5% 二氧化碳。先用 25 微摩尔 Z-VAD 预处理细胞 30 分钟，随后同时加入 100 纳摩尔 SM-164 和 100 纳克 / 毫升人 TNF-α，处理 6 小时。处理结束后，加入 3 毫升补充后的 1 号裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟。

用补充后的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液用于均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的平行对比。

结果显示：使用磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）均相时间分辨荧光检测时，每孔 12,500 个细胞即可检测到显著信号；而使用蛋白质印迹法时，需每孔 25,000 个细胞才能获得最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，磷酸化 RIPK1 均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

assay-validation-ripk1-phospho-s166-6（图示：磷酸化 RIPK1（丝氨酸 166 位点）检测与蛋白质印迹法比较验证）

简化通路

RIPK1 信号通路

RIPK1 是细胞命运决策的核心调控因子，可调控细胞存活、凋亡和坏死性凋亡通路。

细胞存活通路激活：当 TNF-α 与 TNFR1 结合后，受体迅速在细胞质膜上招募多种蛋白质（包括 RIPK1、TRADD、TRAF2 以及细胞凋亡抑制蛋白 1 和 2（cIAP1/2）），形成复合物 I。cIAP1/2 催化 RIPK1 发生多聚泛素化，进而招募 IKKα 和 IKKβ，激活 NF-κB 促存活通路。
细胞凋亡通路激活：在缺乏 cIAP1/2 的情况下，RIPK1 从 TNFR1 上解离，与 FADD 和半胱天冬酶 8（caspase 8）结合形成胞质复合物 IIa，介导半胱天冬酶 8 依赖性细胞凋亡。
坏死性凋亡通路激活：当半胱天冬酶 8 活性受抑制或在病理条件下，RIPK1 与 RIPK3、MLKL 结合形成胞质复合物 IIb（又称 “坏死小体”），启动坏死性凋亡。RIPK1 通过丝氨酸 166 位点自身磷酸化实现激活，这对复合物 IIb 的形成至关重要，并进一步通过磷酸化激活 RIPK3 和 MLKL。MLKL 是坏死性凋亡通路中最下游的效应分子：该蛋白发生寡聚化后转移至细胞膜，导致细胞膜破裂并释放损伤相关分子模式（DAMPs）。

ripk1-phospho-kit-64ripk1s1peg（图示：RIPK1（丝氨酸 166 位点）磷酸化相关信号通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号通路研究
品牌：均相时间分辨荧光（HTRF）
检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（16 µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：10000 次检测

没有数据

货号：64RIPK1S1PEH

一键复制

参考价格 ¥ 172916.60

产品规格

请咨询￥172916.60

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价