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HTRF SHP1 P-Y564 KIT - 10K PTS

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概述

本细胞检测方法旨在监测 SHP1 蛋白在酪氨酸 564（Tyr564）位点的磷酸化水平，该磷酸化是 SHP1 激活的标志性事件。

许多癌细胞会过表达检查点抑制剂配体（如 PD-L1）。PD-L1 会与其对应受体 ——T 淋巴细胞表面的检查点抑制剂受体 PD1（程序性死亡受体 1）结合。随后，PD1-PD-L1 复合物会招募并激活抑制性效应分子（如 SHP1 或 SHP2）。这两种磷酸酶（SHP1 在 Tyr564 位点磷酸化，SHP2 在 Tyr542 位点磷酸化）均由 Lck 激酶催化磷酸化，进而引发 T 细胞激活通路中信号蛋白（如 ZAP-70、SLP-76）的去磷酸化。最终，激活的 SHP1 和 SHP2 会参与 T 细胞的失活过程。

研究认为，通过小分子抑制剂阻止 SHP1 和 / 或 SHP2 的激活，有助于恢复机体对肿瘤的免疫应答。

工作原理

SHP1（Tyr564 位点磷酸化）检测原理

SHP1（Tyr564 位点磷酸化）检测针对 Tyr564 位点发生磷酸化的 SHP1 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为 “免洗涤” 检测模式下评估蛋白质磷酸化状态提供了有效手段。

phospho-shp1-y564-assay-principle（图示：SHP1（Tyr564 位点磷酸化）检测原理）

SHP1（Tyr564 位点磷酸化）双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入 SHP1（Tyr564 位点磷酸化）均相时间分辨荧光（HTRF）检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

phospho-shp1-y564-2-plate-assay-protocol（图示：SHP1（Tyr564 位点磷酸化）双板检测方案）

SHP1（Tyr564 位点磷酸化）单板检测方案

使用均相时间分辨荧光（HTRF）试剂检测 Tyr564 位点磷酸化的 SHP1 蛋白，可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。此专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的均相时间分辨荧光检测质量。

phospho-shp1-y564-1-plate-assay-protocol（图示：SHP1（Tyr564 位点磷酸化）单板检测方案）

检测验证

钒酸盐存在下 Jurkat 细胞中 SHP1 磷酸化的检测

将人 Jurkat 悬浮细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔半体积培养板中，在添加或不添加 30 微摩尔（µM）钒酸盐的条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，加入 10 微升（µL）4 倍浓度（4X）补充型裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡裂解 30 分钟。随后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 SHP1（Tyr564 位点磷酸化）均相时间分辨荧光检测试剂，孵育过夜后记录均相时间分辨荧光信号。

Jurkat 细胞中 SHP1 的磷酸化具有瞬时性，导致其检测难度较大。钒酸盐通过抑制磷酸酶活性，可阻止 SHP1 快速去磷酸化，从而实现对磷酸化 SHP1 的清晰检测。

assay-validation-shp1-phospho-y564-1（图示：钒酸盐存在下 Jurkat 细胞中 SHP1 磷酸化检测结果）

利用 Lck 抑制剂沙拉卡替尼（Saracatinib）在 Jurkat T 细胞中进行药理学验证

将人 Jurkat 悬浮细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔半体积培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下，与梯度浓度的沙拉卡替尼共同孵育 24 小时。裂解前，Jurkat 细胞与 30 微摩尔钒酸盐共同孵育 30 分钟，随后加入 10 微升 4 倍浓度补充型裂解缓冲液。在室温下轻柔振荡裂解 30 分钟后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 4 微升 SHP1（Tyr564 位点磷酸化）或 SHP1 总蛋白均相时间分辨荧光检测试剂，孵育过夜后记录均相时间分辨荧光信号。

如其他研究所述，沙拉卡替尼处理后，SHP1 Tyr564 位点磷酸化水平呈剂量依赖性降低，而相同实验条件下 SHP1 的表达量保持稳定。

assay-validation-shp1-phospho-y564-2（图示：沙拉卡替尼对 Jurkat T 细胞中 SHP1 磷酸化的药理学验证结果）

SHP1 磷酸化均相时间分辨荧光细胞检测与蛋白质印迹法的对比

将人 Jurkat 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。随后，用 30 微摩尔钒酸盐处理细胞 30 分钟，之后进行细胞裂解。

用补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至小体积白色微孔板，加入 4 微升 SHP1 磷酸化均相时间分辨荧光检测试剂。取等量裂解液进行蛋白质印迹法检测，对两种方法进行平行对比。

使用 SHP1（Tyr564 位点磷酸化）均相时间分辨荧光检测时，每孔 1250 个细胞即可检测到信号；而采用基于 ECL（化学发光法）检测的蛋白质印迹法时，需每孔 5000 个细胞才能检测到信号。这些结果表明，SHP1 磷酸化均相时间分辨荧光检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

assay-validation-shp1-phospho-y564-3（图示：SHP1 磷酸化均相时间分辨荧光检测与蛋白质印迹法的对比结果）

简化通路

SHP1 的功能与调控机制

SHP1（又称酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型 6，PTPN6）是一种酪氨酸磷酸酶，主要在造血细胞中表达，可被 Lck 激酶激活并由细胞表面受体招募。SHP2（又称酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型 11）则在造血细胞和非造血细胞中广泛表达。尽管 SHP2 会负向调控 T 细胞激活，但在血小板衍生生长因子（PDGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）等生长因子的刺激下，它会正向参与 ERK（细胞外信号调节激酶）的激活过程。

在 T 淋巴细胞中，SHP1 和 SHP2 会被免疫检查点抑制剂招募，进而参与 T 细胞受体（TCR）信号通路的抑制。SHP1 和 SHP2 与 PD1 的 ITIM 结构域（免疫受体酪氨酸抑制基序）结合，并由 Lck 激酶催化磷酸化而激活。激活后的 SHP1 和 SHP2 磷酸酶会导致 T 细胞受体信号通路中关键效应分子（如 ZAP70、SLP76）的去磷酸化，而这些分子是 T 细胞增殖和发挥功能所必需的。

phospho-pathway-shp1-phospho-y564-kit-64sh1peg（图示：SHP1（Tyr564 位点磷酸化）相关简化通路）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：感染性疾病、肿瘤学与炎症
单位规格：10000 个检测点

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货号：64SH1PEH

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