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HTRF SHP1 P-Y564 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于细胞的检测方法旨在监测 SHP1 在酪氨酸 564 位点（Tyr564）的磷酸化，这是其激活的标志。

许多癌细胞会过度表达检查点抑制剂配体，如 PD-L1。PD-L1 与其对应的检查点抑制剂受体 PD1 结合，而 PD1 存在于 T 淋巴细胞表面。反过来，PD1-PDL1 复合物会招募并激活抑制性效应因子，如 SHP1 或 SHP2。这两种磷酸酶分别在酪氨酸 564 和酪氨酸 542 位点被激酶 Lck 磷酸化，进而触发 T 细胞激活通路中涉及的信号蛋白（如 ZAP-70 或 SLP-76）的去磷酸化。最终，被激活的 SHP1 和 SHP2 会参与 T 细胞的失活过程。

研究认为，通过小分子抑制剂阻止 SHP1 和 / 或 SHP2 的激活，有助于恢复机体对肿瘤的免疫应答。

工作原理

磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）检测原理

磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）检测用于测量在酪氨酸 564 位点发生磷酸化的 SHP1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖于蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的格式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了手段。

磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

在 Jurkat 细胞中，可在过钒酸盐存在的情况下检测到 SHP1 的磷酸化

将人 Jurkat 悬浮细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔半区板中，在有或无 30µM 过钒酸盐的条件下孵育 30 分钟。孵育后，用 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。然后将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 Jurkat 细胞中，SHP1 的磷酸化是瞬时的，因此其检测存在一定难度。过钒酸盐通过抑制磷酸酶活性，可防止 SHP1 的快速去磷酸化，从而能够清晰地检测到磷酸化的 SHP1。

使用 Lck 抑制剂沙卡替尼在 Jurkat T 细胞中进行药理学验证

将人 Jurkat 悬浮细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔半区板中，在 37°C、5% CO₂条件下，与不同浓度的沙卡替尼孵育 24 小时。裂解前，Jurkat 细胞与 30µM 过钒酸盐孵育 30 分钟，随后加入 10µL 补充的 4 倍浓度裂解缓冲液。在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）或总 SHP1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

如其他研究所述，沙卡替尼处理后，SHP1 酪氨酸 564 位点的磷酸化受到剂量依赖性抑制，而在相同实验条件下，SHP1 的表达水平保持稳定。

HTRF 磷酸化 SHP1 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 Jurkat 细胞系接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育。然后用 30µM 过钒酸盐处理细胞 30 分钟后进行裂解。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 SHP1 检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

使用 HTRF 磷酸化 SHP1（酪氨酸 564）检测时，1,250 个细胞 / 孔就足以检测到信号，而蛋白质印迹法（依赖 ECL 检测）则需要 5,000 个细胞。这些结果表明，HTRF 磷酸化 SHP1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

SHP1 的功能与调控

SHP1（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 6，PTPN6）是一种主要在造血细胞中表达的酪氨酸磷酸酶，由 Lck 激活并被细胞表面受体招募。SHP2（也称为非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶 11）在造血细胞或非造血细胞中广泛表达。尽管 SHP2 负向调控 T 细胞激活，但它在响应 PDGF 或 FGF 等生长因子时，正向参与 ERK 的激活。

在 T 淋巴细胞中，SHP1 和 SHP2 被免疫检查点抑制剂招募，从而参与 TCR 信号通路的抑制。SHP1 和 SHP2 与 PD1 的 ITIM 结构域相互作用，并被 Lck 激酶磷酸化和激活。被激活的 SHP1 和 SHP2 磷酸酶会导致 TCR 信号通路中的关键效应因子（如 ZAP70 或 SLP76）去磷酸化，而这些效应因子是 T 细胞增殖和功能所必需的。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64SH1PEY

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