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HTRF SLP-76 P-Y145 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法能够快速、定量地检测酪氨酸 145（Tyr145）位点磷酸化的 SLP-76。ZAP-70 激酶对 SLP-76 的磷酸化会形成一个支架，关键的信号复合物在此支架上组装，进而触发 T 淋巴细胞的活化。在 T 免疫细胞中，磷酸化的 SLP-76（Tyr145）被视为 ZAP-70 活化通路的直接读数指标。

工作原理

磷酸化 SLP-76（Tyr145）检测原理

磷酸化 SLP-76（Tyr145）检测可测量在丝氨酸 376（Ser376）位点发生磷酸化的 SLP-76。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式中即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 SLP-76（Tyr145）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 SLP-76（Tyr145）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 SLP-76（Tyr145）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 SLP-76（Tyr145）时，可在同一板中完成细胞培养、刺激和裂解过程，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

基于人 Jurkat 细胞的磷酸化 SLP-76（Tyr145）细胞检测：HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

Jurkat 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中，于 37°C、5% CO₂环境下的 T175cm² 培养瓶中培养 2 天。取 1.8mL 细胞悬液（1×10⁷个细胞 /mL），用过钒酸盐（终浓度 10mM）刺激 15 分钟。刺激后，在室温下加入 0.6mL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液，裂解细胞 30 分钟。然后将纯裂解物在相同的补充裂解缓冲液中进行系列稀释。取 16µL 各稀释液，分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行分析。通过 HTRF 检测可评估抗 CD3 抗体处理引起的特异性 TCR 活化（见下文药理学验证部分），但由于灵敏度不足，蛋白质印迹法无法检测到该信号。

特异性抗 CD3 抗体激活剂刺激细胞的动力学研究

本检测采用双板方案进行。在 96 孔培养板中，每孔接种 400,000 个 Jurkat 细胞，每孔体积 25µL，使用含 10% FBS 的完全 RPMI 培养基。用终浓度为 20µg/mL 的抗 CD3 抗体在不同时间点（分钟）刺激细胞。刺激后，加入 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。取 16µL 不同处理条件下的细胞裂解物，通过 HTRF 检测磷酸化 SLP-76（Tyr145）和总 SLP-76。结果显示，抗 CD3 抗体可诱导 SLP-76 显著磷酸化，在刺激 5 分钟后达到峰值，而相同条件下总 SLP-76 的水平保持稳定。

人 Jurkat 细胞中 SLP-76 激酶活性的调节

将永生化的 T 淋巴细胞 Jurkat 细胞系接种到 96 孔培养处理板中，每孔 400,000 个细胞，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂环境下孵育过夜。在 SLP-76 活化实验中，用不同浓度的抗 CD3 抗体处理细胞 5 分钟。处理后，加入 50µL 补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。检测步骤：将 16µL 细胞裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4µL HTRF 磷酸化 SLP-76（Tyr145）或总 SLP-76 检测试剂。磷酸化 SLP-76（Tyr145）检测在 3 小时后记录 HTRF 信号，总 SLP-76 检测在过夜后记录信号。结果显示，抗 CD3 抗体可显著激活 ZAP-70 通路，使 Jurkat 细胞中 SLP-76 的磷酸化水平增加 3 倍，而相同条件下总 SLP-76 的水平保持稳定。

简化通路

SLP-76 的功能与调控

T 细胞受体（TCR）的结合会促使淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）磷酸化 TCR/CD3 复合物胞质侧的基于免疫受体酪氨酸的活化基序（ITAMs）。ZAP-70 被招募到 TCR/CD3 复合物上并发生磷酸化激活。ZAP-70 进而磷酸化 SLP-76。活化的 SLP-76 转移至质膜，促进多蛋白复合物的形成，该复合物参与 T 淋巴细胞的活化、存活和增殖过程。

规格参数

项目	详情
应用领域	细胞信号传导
兼容自动化	是
品牌	HTRF
检测方式	HTRF
兼容的裂解缓冲液	裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰	磷酸化
产品类别	试剂盒
样品体积	16 µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷酸化蛋白
靶标物种	人
技术原理	时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域	肿瘤学与炎症
单位规格	500 个检测点

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货号：64SLPY5PEY

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