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HTRF SMAD2 P-S465/467 KIT - 10K PTS

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概述

本 HTRF（均相时间分辨荧光）细胞检测方法可实现对丝氨酸 465/467（Ser465/467）位点磷酸化的 SMAD2 蛋白的快速、定量检测，该指标可作为转化生长因子 -β（TGF-ß）信号通路活性的检测依据。

TGF-ß 受体通过磷酸化 SMAD2 的 Ser465/467 位点直接激活 SMAD2，激活后的 SMAD2 会转移至细胞核内，调控与细胞凋亡、迁移、分化，以及免疫 / 炎症反应、细胞外基质重塑相关的基因表达。

工作原理

SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）检测原理

注：原文中 “Ser465/4267” 为表述误差，结合上下文及通路描述，统一修正为 “Ser465/467”。

SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）检测针对 Ser465/467 位点发生磷酸化的 SMAD2 蛋白进行定量。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

该检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选，可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序；第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为 “免洗涤” 检测模式下评估蛋白质磷酸化状态提供了有效手段。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-smad2-s465-427-assay-principle.svg，即 “SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）检测原理”）

SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）检测方案

1. 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入 SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

（图示标注：phospho-how-it-works-total-smad2-2-plate-assay-protocol.svg，即 “SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）双板检测方案”）

2. 单板检测方案

注：原文重复标注 “双板检测方案”，结合内容修正为 “单板检测方案”。

使用 HTRF 试剂检测 Ser465/467 位点磷酸化的 SMAD2 蛋白，可在单个培养板中完成 —— 该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。此专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：phospho-how-it-works-phospho-smad2-s465-427-1-plate-assay-protocol.svg，即 “SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）单板检测方案”）

检测验证

人 TGFβ 刺激 C2C12 细胞诱导 SMAD2 蛋白 Ser465/467 位点磷酸化

将 C2C12 细胞（小鼠成肌细胞系）以不同细胞密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜。随后，向细胞中加入系列稀释的人 TGFβ，在 37°C、5% 二氧化碳条件下刺激 30 分钟。移除刺激培养基，向细胞中加入 50 微升（µL）裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升样本转移至 384 孔小体积检测板，加入 4 微升 SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）HTRF 检测试剂，孵育过夜后记录信号。

（图示标注：assay-validation-smad2-phospho-s465-1.svg，即 “SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）检测验证 1”）

人及小鼠细胞系中 SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）细胞检测验证

选取 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞系）验证人源蛋白兼容性，选取 NIH 3T3 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）和 C2C12 细胞验证鼠源蛋白兼容性。将这三种细胞系均以每孔 10 万个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。向细胞中加入系列稀释的人 TGFβ，在 37°C、5% 二氧化碳条件下刺激 30 分钟。移除刺激培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升样本转移至 384 孔小体积检测板，加入 4 微升 SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）HTRF 检测试剂，孵育过夜后记录信号。

结果显示，SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）HTRF 检测可同时检测人源和鼠源 SMAD2 蛋白在 Ser465/467 位点的磷酸化状态。

（图示标注：assay-validation-smad2-phospho-s465-2-sahra.svg，即 “SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）检测验证 2”）

小鼠 C2C12 细胞中 SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）细胞检测：HTRF 法与蛋白质印迹法的对比

将小鼠 C2C12 细胞培养至 80% 汇合度，经人 TGFβ 处理后裂解细胞，离心收集可溶性上清液。用裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入 SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）HTRF 细胞检测试剂盒试剂。平行对比结果显示，HTRF 磷酸化检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 32 倍。

（图示标注：assay-principle-il23-il12rb-binding-kit-4.svg，即 “SMAD2（Ser465/467 位点磷酸化）HTRF 法与蛋白质印迹法对比”）

简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号传导由 I 型 TGF-ß 受体（TßRI）和 II 型 TGF-ß 受体（TßRII）复合物介导，该复合物通过磷酸化作用激活细胞内的 SMAD3 和 SMAD2。具体过程如下：

TGF-ß 配体与 TßRII 结合，触发 TßRI 招募至配体 - 受体复合物中；
TßRII 发生自身磷酸化，随后磷酸化 TßRI；
激活的 TßRI 进一步磷酸化 SMAD2 的 Ser465 和 Ser467 位点，使其能够与 SMAD4 形成寡聚体；
该寡聚体转移至细胞核内，与共激活因子和共抑制因子共同作为转录因子，调控与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化，以及细胞外基质重塑、免疫 / 炎症反应相关的多种基因表达；
抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制过程。

（图示标注：553207_update_smad2_pathway_v1.svg，即 “TGF-ß 信号通路简化图”）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）、肿瘤学与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64SMAD2S5PEH

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