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HTRF SMAD2 TOTAL KIT - 500 PTS

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概述

总 SMAD2 细胞检测试剂盒（Total-SMAD2 Cellular Assay Kit）旨在监测 SMAD2 蛋白的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。

该试剂盒可与磷酸化 SMAD2 检测试剂盒（Phospho-SMAD2 Kit）兼容，能够从同一份样本中同时分析磷酸化 SMAD2 与总 SMAD2 的水平，为转化生长因子 -β（TGF-ß）信号通路活性提供更全面、精准的检测依据。

工作原理

总 SMAD2 检测原理

总 SMAD2 检测用于定量细胞裂解液中 SMAD2 蛋白的总表达量（不区分磷酸化状态）。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团，两种抗体均对 SMAD2 蛋白上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMAD2 时，加入这两种抗体偶联物后，供体荧光团与受体荧光团会因抗体与 SMAD2 的结合而近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 SMAD2 蛋白的浓度直接成正比，可在 “免洗涤” 检测模式下实现对 SMAD2 总表达水平的评估。

（图示标注：phospho-how-it-works-total-smad2-assay-principle.svg，即 “总 SMAD2 检测原理”）

总 SMAD2 检测方案

1. 双板检测方案

双板检测方案流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入总 SMAD2 HTRF 检测试剂。该方案可同步监测细胞的活力与汇合度。

（图示标注：phospho-how-it-works-total-smad2-2-plate-assay-protocol.svg，即 “总 SMAD2 双板检测方案”）

2. 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMAD2 蛋白，可在单个培养板中完成 —— 该培养板同时用于细胞培养、刺激及裂解，无需洗涤步骤。此专为高通量筛选（HTS）设计的方案，能在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：phospho-how-it-works-total-smad2-1-plate-assay-protocol.svg，即 “总 SMAD2 单板检测方案”）

检测验证

人 TGFβ 刺激 C2C12 细胞的检测验证

将 C2C12 细胞（小鼠成肌细胞系）以每孔 5 万个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜。向细胞中加入系列稀释的人 TGFβ，在 37°C、5% 二氧化碳条件下刺激 30 分钟后，移除刺激培养基，加入 50 微升（µL）裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。

取 16 微升样本分为两组平行检测：一组转移至 384 孔小体积检测板后加入 4 微升磷酸化 SMAD2 HTRF 检测试剂，另一组加入 4 微升总 SMAD2 HTRF 检测试剂，孵育过夜后记录信号，以同步分析 TGFβ 刺激对 SMAD2 磷酸化水平与总表达水平的影响。

（图示标注：assay-validation-smad2-total-1.svg，即 “总 SMAD2 检测验证 1”）

人及小鼠细胞系中总 SMAD2 的检测验证

选取 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞系）验证人源 SMAD2 的检测兼容性，选取 NIH 3T3 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）和 C2C12 细胞验证鼠源 SMAD2 的检测兼容性。将三种细胞系均以每孔 10 万个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。移除细胞培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，轻柔振荡裂解 30 分钟。取 16 微升样本转移至 384 孔小体积检测板，加入 4 微升总 SMAD2 HTRF 检测试剂，孵育过夜后记录信号。

结果显示，总 SMAD2 HTRF 检测可有效检测人源和鼠源 SMAD2 蛋白。

（图示标注：assay-validation-smad2-total-2.svg，即 “总 SMAD2 检测验证 2”）

小鼠 C2C12 细胞中总 SMAD2 检测：HTRF 法与蛋白质印迹法的对比

将小鼠 C2C12 细胞培养至 80% 汇合度，经人 TGFβ 处理后裂解细胞，离心收集可溶性上清液。用裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板，加入总 SMAD2 细胞检测试剂盒试剂。平行对比结果显示，HTRF 总蛋白检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 9 倍。

（图示标注：assay-validation-smad2-total-3.svg，即 “总 SMAD2 检测验证 3”）

简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号传导由 I 型 TGF-ß 受体（TßRI）和 II 型 TGF-ß 受体（TßRII）复合物介导，该复合物通过磷酸化作用激活细胞内的 SMAD3 和 SMAD2，具体过程如下：

TGF-ß 配体与 TßRII 结合，触发 TßRI 招募至配体 - 受体复合物中；
TßRII 发生自身磷酸化，随后进一步磷酸化激活 TßRI；
激活的 TßRI 催化 SMAD2 的 Ser465 和 Ser467 位点磷酸化，使磷酸化 SMAD2 能够与 SMAD4 形成寡聚体；
该寡聚体转移至细胞核内，与共激活因子、共抑制因子共同作为转录因子，调控与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化，以及细胞外基质重塑、免疫 / 炎症反应相关的多种基因表达；
抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制，维持信号平衡。

（图示标注：553207_update_smad2_pathway_v1bis.svg，即 “TGF-ß 信号通路简化图”）

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（Total，不区分磷酸化状态）
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白（注：此处为产品分类通用标注，实际检测目标为总 SMAD2 蛋白）
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64SMAD2TPEG

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