概述

工作原理

总 SMAD2 检测原理

总 SMAD2 检测方案

1. 双板检测方案

1. 细胞培养与处理：在 96 孔板中接种目标细胞（如 C2C12、HeLa），进行药物刺激或培养至指定时间；
2. 细胞裂解：移除培养基，加入预冷的裂解缓冲液，轻柔振荡 30 分钟，确保细胞充分裂解；
3. 检测转移：取 16μL 裂解液转移至 384 孔小体积检测板中；
4. 试剂反应：加入 4μL 总 SMAD2 HTRF 检测试剂（供体抗体 + 受体抗体混合液），室温孵育过夜；
5. 信号读取：使用 HTRF 专用酶标仪检测供体和受体的荧光强度，计算 FRET 信号比值（受体信号 / 供体信号 ×10000），通过标准曲线换算总 SMAD2 浓度。

2. 单板检测方案

1. 细胞接种与处理：直接在检测板中接种细胞，培养并进行刺激处理；
2. 原位裂解：无需转移细胞，直接向检测板中加入裂解缓冲液，原位裂解细胞；
3. 试剂反应与信号读取：加入总 SMAD2 HTRF 检测试剂，孵育后直接读值。

检测验证

验证 1：人 TGFβ 刺激 C2C12 细胞的同步检测

• 实验设计：将 C2C12 细胞（小鼠成肌细胞系）以 5×10⁴个 / 孔接种于 96 孔板，孵育过夜后用系列稀释的人 TGFβ 刺激 30 分钟；裂解后取 16μL 裂解液分为两组：一组加磷酸化 SMAD2 检测试剂，另一组加总 SMAD2 检测试剂，平行孵育并读值。
• 结果：TGFβ 浓度升高时，磷酸化 SMAD2 的 FRET 信号显著上升（表明通路激活），而总 SMAD2 信号基本稳定（表明蛋白总量无明显变化），证明试剂盒可准确反映磷酸化比例的动态变化，排除总蛋白表达的干扰。

验证 2：人 / 鼠细胞系的兼容性

• 实验设计：分别接种 HeLa 细胞（人宫颈癌细胞，人源 SMAD2）、NIH 3T3 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，鼠源 SMAD2）、C2C12 细胞（小鼠成肌细胞，鼠源 SMAD2），均以 1×10⁵个 / 孔接种，孵育过夜后裂解，用总 SMAD2 检测试剂检测。
• 结果：三种细胞系均能检测到稳定的 FRET 信号，且信号强度与细胞裂解液中 SMAD2 的实际含量匹配，证明试剂盒可跨物种检测人、鼠 SMAD2，无需因物种更换试剂。

验证 3：与 Western Blot 的灵敏度对比

• 实验设计：将 C2C12 细胞培养至 80% 汇合度，经人 TGFβ 处理后裂解，离心取上清并进行系列稀释；分别用总 SMAD2 检测试剂盒和 Western Blot 检测各稀释度样本。
• 结果：HTRF 试剂盒可检测到的最低细胞量是 Western Blot 的 1/9（即 HTRF 灵敏度至少是 Western Blot 的 9 倍），且 HTRF 的检测线性范围更宽（覆盖 2 个数量级以上），适合低丰度样本或微量样本的检测。

简化通路：TGF-ß 信号通路与 SMAD2 的作用

1. 受体激活：TGF-ß 配体与细胞膜上的 II 型 TGF-ß 受体（TßRII）结合，诱导 TßRII 招募并磷酸化 I 型 TGF-ß 受体（TßRI）；
2. SMAD2 磷酸化：激活的 TßRI 特异性磷酸化 SMAD2 的 Ser465/467 位点，使 SMAD2 从非活性状态转为活性状态；
3. 复合物形成与核转位：磷酸化的 SMAD2 与 SMAD4 形成异源寡聚体，进入细胞核；
4. 基因调控：该复合物与共激活因子 / 共抑制因子结合，作为转录因子调控下游靶基因（如 COL1A1、TGFB1 等）的表达，参与细胞外基质重塑、炎症反应等过程；
5. 反馈抑制：抑制性 SMAD6/SMAD7 可与 TßRI 结合，阻断 SMAD2 的磷酸化，形成通路的负反馈调节。

规格参数

• 应用领域：细胞信号传导（TGF-ß 通路活性分析）
• 品牌：HTRF
• 检测方式：均相时间分辨荧光（HTRF）
• 裂解缓冲液兼容性：1 号、2 号、3 号、4 号、5 号裂解缓冲液（无需额外优化，直接使用）
• 分子修饰类型：总蛋白（Total，不区分磷酸化状态）
• 产品类别：试剂盒（含检测抗体、标准品、裂解缓冲液等全套试剂）
• 样本体积：16 μL / 孔（细胞裂解液）
• 运输条件：干冰运输（保障抗体活性和试剂稳定性）
• 靶点类别：磷酸化蛋白（产品分类通用标注，实际检测总 SMAD2）
• 靶点物种：人、小鼠（跨物种兼容）
• 技术平台：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET，降低背景荧光干扰）
• 治疗领域应用：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化（NASH/Fibrosis）、肿瘤学与炎症
• 单位规格：10,000 个检测点（可满足 10,000 次样本检测，适合大规模实验或长期项目）