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HTRF (H/M) SMAD4 TOTAL KIT - 50K PTS

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概述

总 SMAD4 细胞检测试剂盒旨在监测 SMAD4 的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。

该试剂盒与我们的磷酸化 SMAD4 试剂盒兼容，能够从单个样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更准确地反映 TGF-ß 信号活性。

工作原理

总 SMAD4 检测原理

总 SMAD4 检测用于定量细胞裂解物中 SMAD4 的表达水平。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

总 SMAD4 检测使用两种标记抗体：一种偶联有供体荧光团，另一种偶联有受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMAD4 时，加入这些偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会靠近并产生 FRET 信号。信号强度与样品中该蛋白的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白的表达水平。

总 SMAD4 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 SMAD4 HTRF 检测试剂。

该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总 SMAD4 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMAD4 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。

这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

总 SMAD4 细胞系兼容性

选择 HeLa 和 HAPI 细胞系用于测试人源兼容性，选择 NIH 3T3 细胞用于测试鼠源兼容性。将这些不同细胞系的 25,000、50,000 和 100,000 个细胞接种到 96 孔培养板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时后，移除细胞培养基，向各孔中加入 50µL 裂解缓冲液。轻轻振荡裂解 30 分钟后，将 16µL 纯样品转移至 384 孔小体积板中，然后加入 4µL 总 SMAD4 HTRF 检测试剂。过夜后记录信号。

这些数据有助于为不同细胞系选择更合适的细胞密度。总 SMAD4 HTRF 检测能够检测到人源和鼠源的 SMAD4 蛋白。

总 SMAD4 检测特异性

将 HAPI 野生型细胞以每孔 25,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中。

在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜后，用 25nM 的 ON-TARGETplus 小干扰 RNA（Horizon Discovery，专门靶向 SMAD2、SMAD3 和 SMAD4）或非靶向小干扰 RNA（作为对照）处理 HAPI 野生型细胞。在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜后，更换为完全培养基，然后将细胞在 37°C 条件下再孵育 24 小时。

将 HAPI SMAD4 敲除细胞（Horizon Discovery）以每孔 25,000 个细胞的密度接种，孵育 4 天。

孵育后，用 50µL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）裂解细胞，将 16µL 裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后加入 4µL 预混合的 HTRF 总 SMAD4 检测抗体。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。

用 SMAD4 小干扰 RNA 处理细胞会导致总 SMAD4 信号显著下调，与转染非靶向小干扰 RNA 的细胞相比，信号降低 50%。此外，在 HAPI SMAD4 敲除细胞的裂解物中未观察到信号。

另一方面，用 SMAD2 或 SMAD3 小干扰 RNA 处理的细胞未观察到信号降低，这证明了该试剂盒的特异性。使用我们的 HTRF 总 SMAD2 和 SMAD3 检测试剂盒检测 SMAD2 和 SMAD3 的下调情况，显示信号分别降低 60% 和 66%

HTRF 总 SMAD4 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HAPI 细胞在完全培养基中、37°C、5% CO₂条件下于 T175 培养瓶中培养至 80% 汇合度。

用 3mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。

使用补充的 4 号裂解缓冲液（1X）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 SMAD4 检测试剂。过夜后记录信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 SMAD4 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路

TGF-ß 信号通路

TGF-ß 信号通过 TßRI 和 TßRII 复合物介导，该复合物通过磷酸化激活细胞内的 SMAD3 和 SMAD2。TGF-ß 配体与 TßRII 结合，触发 TßRI 招募到配体 - 受体复合物中。TßRII 发生自身磷酸化，然后转磷酸化 TßRI。激活的 TßRI 进而磷酸化 SMAD2 和 SMAD3，使其能够与苏氨酸 277 磷酸化的 SMAD4 形成寡聚体。

这种三聚体复合物随后转运至细胞核内，作为转录因子与共激活因子和共抑制因子共同作用，调控参与细胞生长、凋亡、增殖、迁移、分化以及细胞外基质重塑和免疫 / 炎症反应的多个基因的表达。抑制性 SMAD6 和 SMAD7 参与该通路的反馈抑制。

规格参数

其他规格参数

应用领域：细胞信号传导
兼容自动化：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64SMAD4TPEY

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