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HTRF (H) SMARCA2 TOTAL KIT - 500 PTS 总人源SWI/SNF染色质重塑复合物的催化ATP酶亚基2检测试剂盒，500测试

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概述

SMARCA 基因亚组属于 SWI/SNF 家族，参与染色质重塑与 DNA 损伤修复过程。SWI/SNF 复合物可调控参与 DNA 复制、损伤修复及细胞增殖等关键生命过程的基因。

SMARCA4/BRG1 与 SMARCA2/BRM 是 SWI/SNF 复合物中两种互斥的催化性 ATP 酶亚基。

SMARCA4 功能缺失常与癌症相关，且在 SMARCA4 缺陷型癌症中，SMARCA4 与 SMARCA2 之间的合成致死关系已得到明确证实 —— 即 SMARCA2 失活会导致肿瘤细胞死亡。

在已开展研究的癌症治疗策略中，靶向蛋白降解技术有望克服传统小分子药物的部分局限性。目前，研究人员已开发出 PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）分子，用于诱导 SMARCA 蛋白的选择性降解。然而，SMARCA2 与 SMARCA4 在蛋白质水平上约有 75% 的同源性，因此这类化合物往往会同时靶向两种蛋白。基于此，必须对靶向 SMARCA2 或 SMARCA4 的化合物的选择性进行严格研究。在这类研究中，HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒可作为 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒的重要配套工具，助力实现可靠的化合物谱分析。

工作原理

总 SMARCA2 检测原理

HTRF 总 SMARCA2 检测可对细胞裂解液中 SMARCA2 蛋白的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需使用凝胶、进行电泳或转膜操作。

总 SMARCA2 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 SMARCA2 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SMARCA2 时，加入这两种抗体偶联物后，供体荧光团与受体荧光团会近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中 SMARCA2 蛋白的浓度直接成正比，可在免洗涤检测模式下实现对该蛋白表达水平的评估。

（图示标注：phospho-how-it-works-smarca2-total-assay-principle.svg，即 “总 SMARCA2 检测原理示意图”）

总 SMARCA2 双板检测方案

双板检测方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，随后进行细胞裂解，再将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，最后加入总 SMARCA2 HTRF 检测试剂。该方案可实现对细胞活力及汇合度的监测。

（图示标注：phospho-how-it-works-smarca2-total-assay-protocol-01.svg，即 “总 SMARCA2 双板检测方案流程示意图”）

总 SMARCA2 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SMARCA2 蛋白时，可在单个培养板中完成所有操作 —— 该培养板可同时用于细胞培养、刺激处理及裂解，无需洗涤步骤。此方案为高通量筛选（HTS）设计，可在实现实验微型化的同时，保持稳定可靠的 HTRF 检测质量。

（图示标注：phospho-how-it-works-smarca2-total-assay-protocol-01.svg，即 “总 SMARCA2 单板检测方案流程示意图”）

检测验证

利用相关细胞系验证 HTRF 总 SMARCA2 检测的特异性

采用 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒，在 A549 细胞（肺癌细胞系）和 HAP1 细胞（野生型）中检测 SMARCA2 的表达水平；同时，采用 HTRF 总 SMARCA4 检测试剂盒检测上述细胞中 SMARCA4 的表达水平。实验前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测信号处于试剂盒的动态检测范围内（相关数据未展示）。

将不同细胞系以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升（µL）1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。随后，取 16 微升细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混合的检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示：在 A549 细胞中检测到 SMARCA2 的低水平表达，而 SMARCA4 的表达水平与非特异性信号（虚线标注）相当，表明该细胞中 SMARCA4 不表达，这与文献报道一致（Hoffman, G. R. 等，《美国国家科学院院刊》，2014 年）。

此外，HAP1 细胞中 SMARCA2 的表达水平与非特异性信号（虚线标注）相当，表明该细胞中 SMARCA2 不表达；而正如预期，在 HAP1 细胞中可检测到较高水平的 SMARCA4 表达。

上述结果表明，尽管 SMARCA2 与 SMARCA4 的序列同源性超过 70%，HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒仍对 SMARCA2 具有特异性。

所用细胞系目录编号（购自 Horizon Discovery）：HAP1 野生型 #C631。

（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-1-1.svg、assay-validation-smarca2-total-pharmaco-1-2.svg，即 “利用相关细胞系验证 HTRF 总 SMARCA2 检测特异性的结果图”）

在多种人源细胞系中的验证

将贴壁生长的人源细胞系 HeLa 细胞（宫颈癌细胞系）、HEK293 细胞（肾细胞系）和 A549 细胞（肺癌细胞系）以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升 1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

将悬浮生长的人源细胞系 HEL92.1.7 细胞（红白血病细胞系）和 MOLT-4 细胞（T 淋巴细胞白血病细胞系）以 2×10⁵个细胞 / 孔的密度、30 微升体系接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时，随后用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

采用 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂盒检测 SMARCA2 的表达水平：简要步骤为，取 16 微升细胞裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混合的 HTRF 检测试剂。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。虚线代表非特异性 HTRF 信号。注：实验前已对细胞密度进行优化，以确保 HTRF 检测信号处于试剂盒的动态检测范围内（相关数据未展示）。

结果显示，HTRF 总 SMARCA2 检测可有效检测不同细胞模型中内源性 SMARCA2 的表达（这些细胞模型中 SMARCA2 的表达水平存在差异）。

（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-2.svg，即 “多种人源细胞系中 SMARCA2 检测结果图”）

PROTAC 诱导的 SMARCA2 降解实验

将 HEL92.1.7 细胞以 1×10⁵个细胞 / 30 微升体系接种到 96 孔板中，用浓度递增的 PROTAC 化合物 ACBI1、AU-15330 处理细胞，同时以 PROTAC 化合物 ARV-471（雌激素受体 PROTAC）作为无关阴性对照。孵育过夜后，用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 总 SMARCA2 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示：两种 SMARCA2 PROTAC 降解剂处理细胞后，SMARCA2 蛋白水平呈剂量依赖性下降；而在 ARV-471 对照处理组中，SMARCA2 的表达水平及 ATP 水平均保持稳定。上述结果表明，PROTAC 可诱导 SMARCA2 的特异性降解，其 DC50 * 值处于纳摩尔（nM）级，与预期一致（Farnabay, W. 等，《自然化学生物学》，2019 年；Xiao, L. 等，《自然》，2022 年）。

* 注：DC50 指使 50% 的靶蛋白发生降解时所需降解剂的浓度。

（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-3-1.svg、assay-validation-smarca2-total-pharmaco-3-2.svg，即 “PROTAC 诱导 SMARCA2 降解实验结果图”）

PROTAC 对 SMARCA2 与 SMARCA4 的作用谱分析

（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-4-1.svg、assay-validation-smarca2-total-pharmaco-4-2.svg，即 “PROTAC 对 SMARCA2 与 SMARCA4 作用谱分析相关结果图”）

将 HEL92.1.7 细胞以 1×10⁵个细胞 / 30 微升体系接种到 96 孔板中，用浓度递增的 PROTAC 化合物 ACBI1、AU-15330 处理细胞。孵育过夜后，用 10 微升 4 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 检测抗体（分别使用总 SMARCA2 或总 SMARCA4 检测试剂）。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示：ACBI1 和 AU-15330 可诱导 SMARCA2 和 SMARCA4 的水平呈剂量依赖性下降；在相同实验条件下，ATP 水平保持稳定（相关数据未展示）。上述结果与 Farnabay, W. 等（《自然化学生物学》，2019 年）及 Xiao, L. 等（《自然》，2022 年）的研究结论一致。

ACBI1 的已知靶向蛋白为 SMARCA2、SMARCA4、PBRM1，E3 连接酶配体为 VHL 配体，对总 SMARCA2 的 DC50（纳摩尔）为 224，对总 SMARCA4 的 DC50（纳摩尔）为 231；AU-15330 的已知靶向蛋白为 SMARCA2、SMARCA4、PBRM1，E3 连接酶配体为 VHL 配体，对总 SMARCA2 的 DC50（纳摩尔）为 242，对总 SMARCA4 的 DC50（纳摩尔）为 620。

HTRF 总 SMARCA2 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将 HEL92.1.7 细胞在含完全培养基的 T175 培养瓶中培养，置于 37°C、5% 二氧化碳环境下。孵育 24 小时后，移除培养基，用 3 毫升 1 倍浓度的 1 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

用 1 号补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 总 SMARCA2 检测试剂。

取等量裂解液进行蛋白质印迹实验，与 HTRF 检测结果进行平行对比。

结果显示，在该实验条件下，HTRF 总 SMARCA2 检测的灵敏度与蛋白质印迹法相当。

（图示标注：assay-validation-smarca2-total-pharmaco-5.png，即 “HTRF 总 SMARCA2 检测与 Western Blot 对比结果图”）

简化通路：SMARCA2 信号通路

SMARCA2 与 SMARCA4 是 SWI/SNF 复合物中的催化亚基，参与 DNA 转录和修复过程。SMARCA2 与 SMARCA4 包含 6 个不同的结构域，其中包括 DNA 依赖性 ATP 酶结构域和溴结构域（Bromo 结构域）。溴结构域及组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）水平可调控 DNA 与 SWI/SNF 复合物的结合，而 ATP 酶结构域则负责催化 DNA 双链的解旋。

上述功能会受到 PRC2（多梳抑制复合物 2）复合物中 EZH2 催化亚基的拮抗 ——EZH2 可抑制基因转录。当 SMARCA2 或 SMARCA4 功能缺失时，DNA 损伤会加剧，这是因为 PRC2 会持续结合到核小体上，抑制 DNA 修复过程。

（图示标注：phospho-pathway-smarca2.svg，即 “SMARCA2 信号通路示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（Total）
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64SMARC2TPEG

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