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HTRF (H/M) STAT6 TOTAL KIT - 10K PTS HTRF人源/鼠源全信号转导和转录激活因子6检测试剂盒，10,000测试

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概述

总 STAT6 细胞检测试剂盒（Total STAT6 Cellular Assay Kit）旨在监测 STAT6 蛋白的表达水平，无论其处于磷酸化还是非磷酸化状态。该试剂盒与磷酸化 STAT6 试剂盒（Phospho-STAT6 Kit）兼容，可从同一份样本中同时分析磷酸化蛋白与总蛋白的水平，从而更精准地解读 JAK/STAT 信号通路的活性。

工作原理

总 STAT6 检测原理

总 STAT6 检测可对细胞裂解液中 STAT6 蛋白的整体表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜步骤，大幅简化实验流程。

检测过程中采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 STAT6 蛋白上的特定表位具有高度特异性，且识别的表位互不重叠。当细胞提取物中存在 STAT6 蛋白时，加入这两种抗体偶联物后，供体荧光团与受体荧光团会因抗体与蛋白的结合而近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中 STAT6 蛋白的总浓度直接成正比，且可在免洗涤的检测模式下，快速评估蛋白的整体表达水平。

（标注：stat6 total assay principle，即 “总 STAT6 检测原理示意图”）

总 STAT6 双板检测方案

双板检测方案的操作流程为：先在 96 孔板中完成细胞培养，待细胞培养至目标状态后进行裂解；随后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，最后加入总 STAT6 HTRF 检测试剂进行信号检测。该方案的优势在于可同步监测细胞的活力与汇合度，为实验结果的可靠性提供额外参考（例如排除细胞数量差异对蛋白检测结果的干扰）。

（标注：Phospho stat6 total assay protocol，即 “磷酸化 / 总 STAT6 双板检测方案流程示意图”）

总 STAT6 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 STAT6 时，可在同一培养板中完成细胞培养、刺激处理与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化以节省样本与试剂用量（适配小体积检测板），又能保持 HTRF 检测技术特有的稳定可靠性，适用于大规模样本分析或药物筛选实验。

（标注：Stat6 total assay protocol，即 “总 STAT6 单板检测方案流程示意图”）

检测验证

在人源与鼠源细胞系中验证总 STAT6 检测的适用性

将贴壁细胞（如人 HeLa 细胞、鼠 Raw264.7 细胞）或悬浮细胞（如人 THP-1 细胞）以 1×10⁵个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，孵育 24 小时后，用补充型裂解缓冲液裂解细胞。取 16 微升（µL）裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升总 STAT6 HTRF 检测试剂，室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示：该 HTRF 总 STAT6 检测可在表达不同水平 STAT6 蛋白的多种细胞模型中，高效检测到 STAT6 的表达，验证了其在不同细胞类型中的广泛适用性。

（标注：Assay validation stat6 total，即 “人源与鼠源细胞系中总 STAT6 检测的验证结果图”）

利用 STAT6 基因敲除 HAP1 细胞系验证检测的特异性

采用 HTRF 总 STAT6 检测试剂盒，在 HAP1 野生型（WT）细胞与 STAT6 基因敲除（KO）HAP1 细胞中检测 STAT6 的表达水平。将两种细胞分别以 2×10⁵、1×10⁵、5×10⁴、2.5×10⁴个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。移除培养基后，用 50 微升 1 倍浓度（1X）的 4 号补充型裂解缓冲液裂解细胞，取 16 微升裂解液转移至小体积白色微孔板中，加入 4 微升预混合检测试剂，室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示：在 STAT6 基因敲除 HAP1 细胞中，HTRF 信号与非特异性信号（虚线标注）完全一致，表明 STAT6 基因已完全沉默，且检测无交叉反应，特异性良好；而在野生型 HAP1 细胞中，可清晰检测到 STAT6 的表达，与预期结果相符。

（标注：assay validation stat6 total，即 “STAT6 基因敲除 HAP1 细胞系中检测特异性的验证结果图”）

在 HeLa 细胞系中验证 hIL4 对 STAT6 Tyr641 磷酸化的激活作用

将 HeLa 细胞以 5×10⁴个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，加入完全培养基后在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。次日，用浓度递增的人白细胞介素 4（hIL4）刺激细胞 20 分钟，随后按照双板检测方案操作：取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 4 微升磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂（货号 #64AT6PEG/H/Y）或总 STAT6 检测试剂，室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示：随着 hIL4 浓度升高，STAT6 Tyr641 位点的磷酸化水平呈剂量依赖性上升，而 STAT6 总蛋白的表达水平始终保持稳定，与 hIL4 通过激活 JAK/STAT6 通路诱导 STAT6 磷酸化的已知机制一致，验证了检测对通路活性变化的敏感性。

（标注：Stat6 total，即 “hIL4 激活 HeLa 细胞 STAT6 Tyr641 磷酸化的检测结果图”）

在 HeLa 细胞系中验证药物对 STAT6 Tyr641 磷酸化的抑制作用

将 HeLa 细胞以 5×10⁴个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，加入完全培养基后在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜。次日，用浓度递增的鲁索替尼（Ruxolitinib，JAK1/2 抑制剂）或 JAK 抑制剂 1 处理细胞 2 小时，随后用 5 纳克 / 毫升（ng/mL）的 hIL4 刺激细胞 20 分钟。细胞裂解后，取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，分别加入 4 微升磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂或总 STAT6 检测试剂，室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示：随着鲁索替尼或 JAK 抑制剂 1 浓度升高，STAT6 Tyr641 位点的磷酸化水平呈剂量依赖性下降，而 STAT6 总蛋白的表达水平无明显变化，与 JAK 抑制剂通过抑制上游激酶活性阻断 STAT6 磷酸化的机制一致，进一步验证了检测对通路抑制效应的准确性。

（标注：Assay validation stat6、Stat6 total，即 “药物抑制 HeLa 细胞 STAT6 Tyr641 磷酸化的检测结果图”）

总 STAT6 HTRF 检测与 Western Blot 的灵敏度对比

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，加入完全培养基后在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 48 小时。移除培养基后，用 3 毫升 1 倍浓度的 4 号补充型裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，加入 4 微升总 STAT6 HTRF 检测试剂；同时取等量稀释后的裂解液进行 Western Blot 实验（采用 ECL 化学发光检测），对两种方法的灵敏度进行平行对比。

结果显示：使用 HTRF 总 STAT6 检测时，仅需 300 个细胞 / 孔即可检测到显著信号；而 Western Blot（ECL 检测）需 2×10⁴个细胞 / 孔才能检测到信号。在该实验条件下，HTRF 总 STAT6 检测的灵敏度是 Western Blot 的 60 倍。

（标注：Assay validation stat6，即 “总 STAT6 HTRF 检测与 Western Blot 的灵敏度对比结果图”）

简化通路：STAT6 的功能与调控机制

STAT6 的磷酸化主要由细胞因子和生长因子诱导：当细胞因子（如 IL4）与细胞膜受体结合后，会激活受体关联的 JAK 激酶（Janus 激酶），JAK 进一步催化 STAT6 发生磷酸化。磷酸化后的 STAT6 蛋白会形成同源二聚体或异源二聚体，随后转运至细胞核内，结合到特定的 DNA 序列上，调控细胞因子诱导的基因表达（例如诱导抗凋亡基因 BCL2L1/BCL-X (L) 的表达，这是 IL4 发挥抗凋亡作用的关键机制）。

此外，已有研究表明，TBK1 激酶也可介导 STAT6 的磷酸化，该过程与 STING 通路（干扰素基因刺激蛋白通路）相关，因此 STAT6 在病毒感染诱导的先天免疫反应中也发挥一定作用。

（标注：stat6，即 “STAT6 信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（Total，涵盖磷酸化与非磷酸化状态）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白（可检测总蛋白，含磷酸化形式）
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64STAT6TPEH

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