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HTRF STING P-S366 KIT - 500 PTS 磷酸化STING(S366)检测试剂盒 - 500测试

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概述

这款基于细胞的 HTRF 检测（磷酸化 STING Ser366 检测）可便捷且精准地定量 Ser366 位点磷酸化的 STING 蛋白。当病原体感染发生、双链 DNA（dsDNA）与胞质传感器 cGAS 结合后，STING 蛋白会被 TBK1 激酶磷酸化；磷酸化的 STING 可与 IRF3 结合，进而诱导 I 型干扰素（IFNs）的产生。随后，STING 通路会通过自噬介导的 STING 降解过程被关闭。

在肿瘤免疫领域，激活 STING 通路已在临床前模型中展现出良好的抗肿瘤效果，因此该通路成为治疗人类癌症的重要潜在治疗策略。

工作原理

磷酸化 STING（Ser366）检测原理

磷酸化 STING（Ser366）检测可定量分析 Ser366 位点磷酸化的 STING 蛋白水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜步骤，大幅简化实验流程。

检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。其中，第一种抗体可特异性结合 STING 蛋白上 Ser366 磷酸化的基序，仅识别磷酸化形式的 STING；第二种抗体则不依赖 STING 的磷酸化状态，可普遍识别 STING 蛋白本身。当 STING 发生磷酸化时，两种抗体共同结合于目标蛋白，形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样本中磷酸化 STING 的浓度直接成正比，且可在免洗涤的检测模式下，快速评估 STING 的磷酸化状态。

（标注：Phospho how it works phospho sting，即 “磷酸化 STING（Ser366）检测原理示意图”）

磷酸化 STING（Ser366）双板检测方案

双板检测方案的操作流程为：先在 96 孔板中完成细胞培养，待细胞培养至目标状态后进行裂解；随后将裂解液转移至小体积检测板（可为 HTRF 384 孔小体积板或 96 孔小体积板）中，最后加入磷酸化 STING（Ser366）HTRF 检测试剂进行信号检测。该方案的优势在于可同步监测细胞的活力与汇合度，为实验结果的可靠性提供额外参考（例如排除细胞存活状态对通路激活检测的干扰）。

（标注：Sting plate assay protocol，即 “磷酸化 STING（Ser366）双板检测方案流程示意图”）

磷酸化 STING（Ser366）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STING（Ser366）时，可在同一培养板中完成细胞培养、刺激处理与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案专为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化以节省样本与试剂用量，又能保持 HTRF 检测技术特有的稳定可靠性，适用于大规模药物筛选（如 STING 通路激活剂筛选）或批量样本分析。

（标注：Sting plate assay protocol，即 “磷酸化 STING（Ser366）单板检测方案流程示意图”）

检测验证

1. 2’-3’环磷酸鸟苷 - 腺苷（2’-3’ cGAMP）诱导 THP1 细胞中 STING 磷酸化

将人 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）以 4×10⁵个细胞 / 孔的密度、25 微升（µL）体系接种到 96 孔板中（使用完全培养基）。用浓度递增的 2’-3’ cGAMP（5 微升体系）刺激细胞 4 小时后，加入 10 微升 4 倍浓度（4X）的 4 号补充型裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 STING 或总 STING 检测抗体；同时，取 4 微升细胞裂解液，使用对应的 HTRFα- 微管蛋白（Alpha-tubulin）内参试剂盒分析内参蛋白水平。室温孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示：如已有研究报道，2’-3’ cGAMP 可显著激活 STING 通路，使 STING 磷酸化水平提升 6 倍；同时，STING 磷酸化的诱导伴随其总蛋白表达水平的下调（与自噬介导的 STING 降解机制一致），而 α- 微管蛋白在内相同条件下表达稳定，验证了检测结果的特异性。

（标注：Assay validation sting phospho，即 “2’-3’ cGAMP 诱导 THP1 细胞 STING 磷酸化的检测结果图”）

2. HTRF 磷酸化与总 STING 检测可精准定量激动剂诱导的 STING 调控

将 4×10⁵个 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）以 25 微升体系接种到 96 孔板中（使用完全培养基）。用浓度递增的 2’-3’ cGAMP（5 微升体系）刺激细胞 4 小时后，加入 10 微升 4 倍浓度的 4 号补充型裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

取 16 微升裂解液，分别通过 HTRF 检测与 Western Blot 检测进行平行分析。结果显示：HTRF 检测可对化合物作用效果进行精准的统计分析 —— 如以下图表所示，400 微摩尔（µM）的 cGAMP 可显著降低总 STING 与磷酸化 STING 的水平（统计方法：单因素方差分析，One way-Anova，P 值 < 0.0001）。

（标注：Assay validation sting phospho，即 “HTRF 与 Western Blot 定量激动剂调控 STING 的对比结果图”）

3. 磷酸化 STING 细胞 HTRF 检测与 Western Blot 的灵敏度对比

将人 THP1-R232 细胞接种到 T175 培养瓶中（使用完全培养基），在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 2 天。用 100 微摩尔的 2’-3’ cGAMP 刺激细胞 4 小时后，加入 3 毫升 4 号补充型裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 STING 检测试剂；同时，取等量稀释后的裂解液进行 Western Blot 实验（采用 ECL 化学发光检测），对两种方法的灵敏度进行平行对比。

结果显示：使用 HTRF 磷酸化 STING 检测时，仅需 4,000 个细胞 / 孔即可检测到显著信号；而 Western Blot（ECL 检测）需 63,000 个细胞 / 孔才能检测到最低信号。在该实验条件下，HTRF 磷酸化 STING 检测的灵敏度是 Western Blot 的 16 倍。

（标注：Assay validation sting phospho，即 “磷酸化 STING HTRF 检测与 Western Blot 的灵敏度对比结果图”）

简化通路：STING 信号通路

STING（干扰素基因刺激蛋白，Stimulator of Interferon Genes）是一种定位于内质网的胞质同源二聚体蛋白，在先天免疫中发挥核心作用。当病原体感染发生，或细胞凋亡过程中线粒体收缩释放双链 DNA 时，游离的双链 DNA 会结合并激活 DNA 传感器 —— 环磷酸鸟苷 - 腺苷合成酶（cGAS）。

激活后的 cGAS 会催化生成环二核苷酸 2’-3’ cGAMP，该分子进一步结合 STING 蛋白；随后，STING 被磷酸化并与 TBK1（TANK 结合激酶 1）相互作用，进而招募并激活干扰素调节因子 3（IRF3）—— 激活的 IRF3 形成二聚体并转运至细胞核内，启动 I 型干扰素（IFN-α/β）编码基因的转录。此外，STING 通路还可调控 NF-κB 依赖性炎症细胞因子的表达。

作为负反馈调节机制，DNA 激活的 cGAS-STING-TBK1 通路还会通过 p62/SQSTM1 相关的自噬途径触发 STING 蛋白降解，从而关闭 IFN-β 的产生，避免免疫反应过度激活。

（标注：Phospho pathway sting，即 “STING 信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化（Phosphorylation，针对 Ser366 位点）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（µL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：感染性疾病、肿瘤学与炎症（Infectious Diseases, Oncology & Inflammation）
单位规格：500 个检测点

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