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HTRF STING P-S366 KIT - 50K PTS

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概述

这种基于 HTRF 细胞的检测方法可便捷、准确地定量 Ser366 位点磷酸化的 STING 蛋白。在病原体感染以及双链 DNA（dsDNA）与胞质传感器 cGAS 结合后，STING 蛋白会被 TBK1 磷酸化，使其能够与 IRF3 结合，进而诱导 Ⅰ 型干扰素的产生。随后，STING 通路会通过自噬相关的 STING 降解过程被关闭。在免疫肿瘤学领域，激活 STING 通路在临床前模型中已显示出良好的抗肿瘤效果，因此它代表了一种治疗人类癌症的潜在策略。

工作原理

磷酸化 STING（Ser366）检测原理

磷酸化 STING（Ser366）检测用于测量 Ser366 位点磷酸化的 STING 蛋白。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使这两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式下，可用于评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 STING（Ser366）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解液转移到小体积检测板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板均可），之后添加 HTRF 磷酸化 STING（Ser366）检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 STING（Ser366）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STING（Ser366）可在单个平板中完成，该平板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

2’-3’- 环磷酸鸟苷 - 腺苷（cGAMP）诱导 THP1 细胞中 STING 磷酸化
将人 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）以 25µL 的体积接种到 96 孔板中（400,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基培养。用不同浓度的 2’-3’-cGAMP 刺激细胞（5µL，刺激 4 小时）。然后加入 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。将 16µL 裂解液转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 STING 或总 STING 检测抗体。此外，使用相应的 HTRFα- 微管蛋白内参试剂盒，从 4µL 细胞裂解液中分析 α- 微管蛋白内参蛋白。最后，在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号。如其他文献所述，2’-3’-cGAMP 可显著激活 STING 通路，使 STING 磷酸化水平增加 6 倍。诱导的 STING 磷酸化与 STING 表达水平下调相关，这与自噬介导的降解一致，而在相同条件下 α- 微管蛋白保持稳定。
HTRF 磷酸化和总 STING 检测可准确定量激动剂诱导的 STING 调控
将 400,000 个 THP1-R232 细胞（购自 Invivogen 公司）以 25µL 的体积接种到 96 孔板中，使用完全培养基培养。用不同浓度的 2’-3’-cGAMP 刺激细胞（5µL，刺激 4 小时）。然后加入 10µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。取 16µL 裂解液分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行分析。如下方图表所示，通过 HTRF 进行的信号定量可对化合物效果进行准确的统计分析，其中 400µM 的 cGAMP 显著降低了总 STING 和磷酸化 STING 的水平（所用统计方法：单因素方差分析，P 值 < 0.0001）。
HTRF 磷酸化 STING 细胞检测与蛋白质印迹法的比较
将人 THP1-R232 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下孵育 2 天。然后用 100µM 2’-3’-cGAMP 刺激细胞 4 小时，加入 3mL 补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡 30 分钟以裂解细胞。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 磷酸化 STING 检测试剂。使用等量的裂解液进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。
结果显示，使用 HTRF 磷酸化 STING 检测时，每孔仅需 4,000 个细胞即可检测到显著信号，而使用蛋白质印迹法通过 ECL 检测到最低信号则需要 63,000 个细胞。因此，在本实验中，HTRF 磷酸化 STING 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 16 倍。

简化通路

STING（即干扰素基因刺激因子）是一种定位于内质网的胞质同源二聚体蛋白，在先天免疫中发挥重要作用。当病原体感染或细胞凋亡过程中线粒体收缩时，游离的双链 DNA 会结合并激活 DNA 传感器 —— 环 GMP-AMP 合成酶（cGAS）。激活的 cGAS 会促使 2’-3’-cGAMP（一种环二核苷酸）的产生，随后 2’-3’-cGAMP 与 STING 蛋白结合。继而，磷酸化的 STING 与 TANK 结合激酶 1（TBK1）相互作用，招募并激活干扰素调节因子 3（IRF3）二聚体。IRF3 二聚体进入细胞核后，会启动编码 IFN-α/β 的基因转录。此外，STING 通路还调控 NF-κB 依赖的炎性细胞因子表达。作为负反馈循环，DNA 刺激的 cGAS-STING-TBK1 通路还会通过 p62 SQSTM1 相关的自噬触发 STING 蛋白降解，从而关闭 IFNβ 的产生。

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：传染病、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64STGPEY

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