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HTRF SYK TOTAL KIT - 500 PTS 总脾酪氨酸激酶检测试剂盒

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概述

总 SYK 细胞检测试剂盒（Total SYK Cellular Assay）可监测 SYK 蛋白的总表达水平，且能与磷酸化 SYK（Tyr525/526）试剂盒搭配使用，作为归一化检测工具。该试剂盒与磷酸化 SYK 试剂盒的缓冲液完全兼容，因此同一份细胞裂解液可同时用于分析磷酸化 SYK 与总 SYK 的水平，无需额外处理样本。

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在 B 细胞、巨噬细胞、小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）、中性粒细胞和肥大细胞等免疫细胞中。当细胞受到刺激时，SYK 会与激活的免疫受体胞质结构域相互作用，并结合其特定的磷酸化受体基序（称为 “p-ITAMs”），进而通过催化结构域 Tyr525/526 位点的自磷酸化实现激活。

SYK 的磷酸化水平是 BCR（B 细胞受体）、FcR（Fc 受体）和 TREM2（髓系细胞触发受体 2）等关键炎症通路的重要检测指标，这些通路在自身免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症及过敏性疾病等多种病理状态下会发生异常改变。

工作原理

总 SYK 检测原理

总 SYK 检测可对细胞裂解液中 SYK 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜。总 SYK 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 SYK 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 SYK 时，加入这两种偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会因结合于同一 SYK 分子而近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中 SYK 蛋白的浓度呈直接正相关，且可在免洗涤检测模式下评估 SYK 的表达水平。

（标注：Phospho syk assay principle，即 “总 SYK 检测原理示意图”）

总 SYK 双板检测方案

双板检测方案的操作流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，随后裂解细胞；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 SYK HTRF 检测试剂。该方案可同时监测细胞的活力与汇合度。

（标注：phospho syk plate assay protocol，即 “总 SYK 双板检测方案流程示意图”）

总 SYK 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 SYK 时，可在同一块培养板中完成细胞培养、刺激与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持 HTRF 技术的高稳定性。

（标注：Phospho how it works total syk，即 “总 SYK 单板检测方案流程示意图”）

检测验证

抗 IgM 刺激 Ramos B 细胞诱导 SYK 激活

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系以每孔 10 万个细胞、20 微升无血清培养基的规格接种到 96 孔培养板（半板）中。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，加入 10 微升不同浓度的抗人 IgM 抗体刺激细胞 10 分钟，随后加入 10 微升 4 倍浓度（4X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。检测阶段，将 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示，抗人 IgM 抗体可诱导 SYK Tyr525/526 位点磷酸化水平呈剂量依赖性升高，而 SYK 蛋白的表达水平未发生改变，这表明细胞表面 BCR 复合物已被激活。

（标注：Assay validation syk total，即 “抗 IgM 刺激 Ramos B 细胞激活 SYK 的检测结果图”）

P505-15 处理巨噬细胞分化的 THP-1 细胞抑制 SYK 活性

将人单核细胞 THP-1 细胞系以每孔 20 万个细胞的规格接种到 96 孔培养板中，加入 100 纳克 / 毫升的佛波酯（PMA），在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时，诱导细胞分化为巨噬细胞。分化完成后，先用不同浓度的 SYK 抑制剂 P505-15 处理细胞 1 小时，再用 250 微摩尔的过钒酸盐刺激细胞 10 分钟。处理结束后，加入 50 微升 1 倍浓度（1X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；将 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果符合预期：SYK 抑制剂 P505-15 可诱导 SYK Tyr525/526 位点磷酸化水平呈剂量依赖性降低，而该激酶的表达水平未受药物处理影响。

（标注：Assay validation syk total，即 “P505-15 抑制 THP-1 巨噬细胞 SYK 活性的检测结果图”）

总 SYK HTRF 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。离心后，收集细胞沉淀，用 20 微克 / 毫升的抗人 IgM 抗体刺激 10 分钟；再次离心后，加入 10 毫升 1 倍浓度（1X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 总 SYK 检测试剂。同时，取等量裂解液进行 Western Blot 检测，对两种方法进行平行对比。

结果显示：使用 HTRF 总 SYK 检测时，每孔仅需 500 个细胞即可检测到显著信号；而使用 Western Blot 检测时，需 2000 个细胞才能检测到最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，HTRF 总 SYK 检测的灵敏度是 Western Blot 技术的 4 倍。

（标注：Assay validation syk total，即 “总 SYK HTRF 检测与 Western Blot 的灵敏度对比结果图”）

简化通路

SYK 信号通路简化机制

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在 B 细胞和小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）等免疫细胞中。

当 B 细胞受体复合物或 TREM2/DAP12 受体复合物受到刺激时，SYK 会通过结合 CD79 亚基或 DAP12 胞质结构域上特定的磷酸化受体基序（称为 “p-ITAMs”），分别与 CD79 亚基或 DAP12 相互作用。这一过程会导致 SYK 催化结构域 Tyr525/526 位点发生自磷酸化，从而激活 SYK。激活后的 SYK 会进一步磷酸化 BTK（布鲁顿酪氨酸激酶）等下游底物，触发多条信号通路的激活，进而引发细胞激活、增殖和存活等细胞应答。

（标注：Phospho pathway syk total kit，即 “SYK 信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白（Total，涵盖 SYK 的磷酸化与非磷酸化状态）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（μL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人（Human）
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

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货号：64SYKTPEG

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