当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF SYK P-Y525/526 KIT - 500 PTS 磷酸化SYK试剂盒-500测试

HTRF SYK P-Y525/526 KIT - 500 PTS 磷酸化SYK试剂盒-500测试

分享给好友

下载产品资料

rvty_ls_manual_64SYKY525PEG-64SYKY525PEH

下载SDS

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

这款基于细胞的 HTRF 检测可便捷且精准地检测 Tyr525/526 位点磷酸化的 SYK 蛋白（脾酪氨酸激酶）。

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在 B 细胞、巨噬细胞、小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）、中性粒细胞和肥大细胞等免疫细胞中。当细胞受到刺激时，SYK 会与激活的免疫受体胞质结构域相互作用，并结合其特定的磷酸化受体基序（称为 “p-ITAMs”，磷酸化免疫受体酪氨酸激活基序），进而通过催化结构域 Tyr525/526 位点的自磷酸化实现激活。

SYK 的磷酸化水平是 BCR（B 细胞受体）、FcR（Fc 受体）和 TREM2（髓系细胞触发受体 2）等关键炎症通路的重要检测指标，这些通路在自身免疫性疾病、神经退行性疾病、癌症及过敏性疾病等多种病理状态下会发生异常改变。

作用原理

磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测原理

磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测可定量分析 Tyr525/526 位点磷酸化的 SYK 蛋白水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜。检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体可特异性结合蛋白上的磷酸化基序（仅识别磷酸化 SYK），第二种抗体则不依赖蛋白的磷酸化状态，可普遍识别 SYK 蛋白本身（识别总 SYK）。当蛋白发生磷酸化时，两种标记抗体会形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中磷酸化蛋白的浓度呈直接正相关，且可在免洗涤检测模式下评估蛋白的磷酸化状态。

（标注：Phospho syk tyr525 526 assay principle，即 “磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测原理示意图”）

磷酸化 SYK（Tyr525/526）双板检测方案

双板检测方案的操作流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，随后裂解细胞；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入磷酸化 SYK（Tyr525/526）HTRF 检测试剂。该方案可同时监测细胞的活力与汇合度。

（标注：Syk tyr525 526 2 plate assay protocol，即 “磷酸化 SYK（Tyr525/526）双板检测方案流程示意图”）

磷酸化 SYK（Tyr525/526）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Tyr525/526 位点磷酸化的 SYK 时，可在同一块培养板中完成细胞培养、刺激与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持 HTRF 技术的高稳定性。

（标注：Phospho syk plate-assay protocol，即 “磷酸化 SYK（Tyr525/526）单板检测方案流程示意图”）

检测验证

诱导多能干细胞（iPSC）来源巨噬细胞中 TREM2 通路的激活

将亲本型（BIONi010-C，EBiSC 编号 66540023）和 TREM2 基因敲除型（BIONi010-C-17，EBiSC 编号 66540632）的人诱导多能干细胞来源巨噬细胞（按 Van Wilgenburg 等人 2013 年发表的方法分化，参考文献 1）以每孔 4 万个细胞的密度接种到 96 孔板中。培养 8 天后，用 5 微克 / 毫升的抗 TREM2 抗体（已知可激活该受体）或对应的同型对照抗体（山羊 IgG 抗体）处理细胞 5 分钟。移除培养基后，加入 50 微升 1 倍浓度（1X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；随后将 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果符合预期：抗 TREM2 抗体可诱导亲本型 iPSC 来源巨噬细胞中 TREM2 通路激活，具体表现为 Tyr525/526 位点 SYK 磷酸化水平升高；而该处理对 TREM2 基因敲除细胞系中 SYK 蛋白的磷酸化状态无调控作用 *。

* 此数据由英国阿尔茨海默病研究中心牛津药物发现研究所（ODDI）合作提供。

（参考文献 1）Van Wilgenburg 等人，《在部分限定及完全限定条件下，从人多能干细胞高效、长期生成单核细胞来源巨噬细胞》；2013 年；《公共科学图书馆・综合》（PLOS One）；第 8 卷，第 8 期。

（标注：Assay validation，即 “iPSC 来源巨噬细胞中 TREM2 通路激活的检测结果图”）

抗 IgM 刺激 Ramos B 细胞诱导 SYK 激活

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系以每孔 10 万个细胞、20 微升无血清培养基的规格接种到 96 孔培养板（半板）中。在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育过夜后，加入 10 微升不同浓度的抗人 IgM 抗体刺激细胞 10 分钟，随后加入 10 微升 4 倍浓度（4X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。检测阶段，将 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果显示，抗人 IgM 抗体可诱导 SYK Tyr525/526 位点磷酸化水平呈剂量依赖性升高，而 SYK 蛋白的表达水平未发生改变，这表明细胞表面 BCR 复合物已被激活。

（标注：Assay validation syk phospho tyr，即 “抗 IgM 刺激 Ramos B 细胞激活 SYK 的检测结果图”）

P505-15 处理巨噬细胞分化的 THP-1 细胞抑制 SYK 活性

将人单核细胞 THP-1 细胞系以每孔 20 万个细胞的规格接种到 96 孔培养板中，加入 100 纳克 / 毫升的佛波酯（PMA，佛波醇 - 12 - 肉豆蔻酸酯 - 13 - 乙酸酯），在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时，诱导细胞分化为巨噬细胞。分化完成后，先用不同浓度的 SYK 抑制剂 P505-15 处理细胞 1 小时，再用 250 微摩尔的过钒酸盐刺激细胞 10 分钟。处理结束后，加入 50 微升 1 倍浓度（1X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟；将 16 微升细胞裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）或总 SYK 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

结果符合预期：SYK 抑制剂 P505-15 可诱导 SYK Tyr525/526 位点磷酸化水平呈剂量依赖性降低，而该激酶的表达水平未受药物处理影响。

（标注：Assay validation syk phospho tyr，即 “P505-15 抑制 THP-1 巨噬细胞 SYK 活性的检测结果图”）

磷酸化 SYK（Tyr525/526）HTRF 检测与蛋白质印迹法（Western Blot）的对比

将人 B 细胞淋巴瘤 Ramos 细胞系接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 48 小时。离心后，收集细胞沉淀，用 20 微克 / 毫升的抗人 IgM 抗体刺激 10 分钟；再次离心后，加入 10 毫升 1 倍浓度（1X）的 3 号补充裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测试剂。同时，取等量裂解液进行 Western Blot 检测，对两种方法进行平行对比。

结果显示：使用 HTRF 磷酸化 SYK（Tyr525/526）检测时，每孔仅需 1000 个细胞即可检测到显著信号；而使用 Western Blot 检测时，需 4000 个细胞才能检测到最低化学发光信号。因此，在该实验条件下，HTRF 磷酸化 SYK 检测的灵敏度是 Western Blot 技术的 4 倍。

（标注：Assay validation syk phospho tyr，即 “磷酸化 SYK（Tyr525/526）HTRF 检测与 Western Blot 的灵敏度对比结果图”）

简化通路

SYK 信号通路简化机制

SYK（脾酪氨酸激酶）是一种胞质酪氨酸 / 丝氨酸激酶，在信号转导中发挥关键作用，尤其在 B 细胞和小胶质细胞（脑内驻留巨噬细胞）等免疫细胞中。

当 B 细胞或 TREM2/DAP12（髓系细胞触发受体 2/DNAX 激活蛋白 12）受体复合物受到刺激时，SYK 会通过结合 CD79 亚基或 DAP12 胞质结构域上特定的磷酸化受体基序（称为 “p-ITAMs”），分别与 CD79 亚基或 DAP12 相互作用。这一过程会导致 SYK 催化结构域 Tyr525/526 位点发生自磷酸化，从而激活 SYK。激活后的 SYK 会进一步磷酸化 BTK（布鲁顿酪氨酸激酶）等下游底物，触发多条信号通路的激活，进而引发细胞激活、增殖和存活等细胞应答。

（标注：Syk phospho kit，即 “SYK 信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化（针对 SYK 蛋白 Tyr525/526 位点）
产品类别：试剂盒（Kit）
样本体积：16 微升（μL）
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人（Human）
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域：神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64SYKY525PEG

一键复制

参考价格 ¥ 29723.99

产品规格

1盒/500测试￥29723.99

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价