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HTRF P53 TOTAL KIT - 96 PTS

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概述

总 p53 细胞检测试剂盒可与磷酸化 p53 试剂盒搭配使用，作为归一化检测工具。p53 因在维护基因组完整性中发挥关键作用，被称为 “基因组的守护者”。p53 具有多种抗癌功能机制，通过调控各类靶基因的表达，可影响细胞凋亡、衰老、细胞周期调控、生长停滞、基因组稳定性、血管生成抑制及代谢变化等过程。

作用原理

总 p53 检测原理

总 p53 检测可对细胞裂解液中 p53 蛋白的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜。总 p53 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 p53 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 p53 时，加入这两种偶联抗体后，供体荧光团与受体荧光团会因结合于同一 p53 分子而近距离接触，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样本中 p53 蛋白的浓度呈直接正相关，且可在免洗涤检测模式下评估 p53 的表达水平。

（标注：Total p53 assay principle，即 “总 p53 检测原理示意图”）

总 p53 双板检测方案

双板检测方案的操作流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，随后对细胞进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入总 p53 HTRF（均相时间分辨荧光）检测试剂。该方案可同时监测细胞的活力与汇合度。

（标注：Total p53 2 plate assay protocol，即 “总 p53 双板检测方案流程示意图”）

总 p53 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 p53 时，可在同一块培养板中完成细胞培养、刺激与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案为高通量筛选（HTS）设计，既能实现实验微型化，又能保持 HTRF 技术的高稳定性。

（标注：Total p53 1 plate assay protocol，即 “总 p53 单板检测方案流程示意图”）

检测验证

人 MCF-7 细胞中 p53 磷酸化与总 p53 的 HTRF 检测与蛋白质印迹法（WB）对比

将人 MCF-7 细胞以每孔 10⁶个细胞的密度接种到 6 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳（CO₂）条件下孵育 24 小时。经紫外线（UV）处理 5 分钟（剂量为 2.1 焦耳 / 平方厘米，J/cm²）后，加入 200 微升（μL）裂解缓冲液，在室温（RT）下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。使用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16 微升各稀释度的裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF 磷酸化 p53（Ser15，即 15 号丝氨酸位点）检测试剂。取等量裂解液进行蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 检测的平行对比。结果显示，两种 p53 的 HTRF 检测灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

（标注：Assay validation p53 total，即 “人 MCF-7 细胞 p53 HTRF 检测与 WB 灵敏度对比结果图”）

新制癌菌素处理的 MCF-7 乳腺癌细胞总 p53 检测验证

将人 MCF-7 细胞以每孔 10 万个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。用不同浓度的新制癌菌素（Neocarcinostatin）处理细胞 45 分钟后，移除培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

（标注：assay validation p53total，即 “新制癌菌素处理 MCF-7 细胞总 p53 检测结果图”）

依托泊苷（凋亡诱导剂）处理的 MCF-7 乳腺癌细胞总 p53 检测验证

将人 MCF-7 细胞以每孔 20 万个细胞的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。用不同浓度的依托泊苷（Etoposide，一种凋亡诱导剂）处理细胞 3 小时后，移除培养基，加入 50 微升裂解缓冲液，在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF 磷酸化 p53（Ser15）或总 p53 检测试剂，孵育过夜后记录 HTRF 信号。

（标注：Assay validation，即 “依托泊苷处理 MCF-7 细胞总 p53 检测结果图”）

简化通路

p53 的功能与调控机制

多种应激信号可激活 p53，包括但不限于 DNA 损伤、氧化应激、渗透压休克、核糖核苷酸耗竭及癌基因表达失调。在应对这些应激时，p53 会发生大量翻译后修饰，包括磷酸化和乙酰化。p53 的磷酸化主要发生在 N 端的 Ser15（15 号丝氨酸）位点，该修饰会降低 p53 与其负调控因子 —— 癌蛋白 MDM2（鼠双微体蛋白 2）的相互作用。MDM2 通过介导 p53 的泛素化和蛋白酶体降解来抑制其积累，而 Ser15 位点的磷酸化会削弱 MDM2 与 p53 的结合能力，从而在 DNA 损伤应激下促进 p53 的积累与激活。

（标注：Phospho pathway p53 64t53，即 “p53 功能与调控通路简化示意图”）

规格参数

应用领域（Application）：细胞信号传导（Cell Signaling）
品牌（Brand）：HTRF
检测方式（Detection Modality）：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性（Lysis Buffer Compatibility）：1 号裂解缓冲液（Lysis Buffer 1）
分子修饰类型（Molecular Modification）：总蛋白（Total，涵盖 p53 的磷酸化与非磷酸化状态）
产品类别（Product Group）：试剂盒（Kit）
样本体积（Sample Volume）：16 微升（16 μL）
运输条件（Shipping Conditions）：干冰运输（Shipped in Dry Ice）
靶点类别（Target Class）：磷酸化蛋白（Phosphoproteins）
靶点物种（Target Species）：人（Human）
技术平台（Technology）：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域（Therapeutic Area）：肿瘤学与炎症（Oncology & Inflammation）
单位规格（Unit Size）：96 个检测点（96 assay points）

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货号：64T53PET

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