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HTRF TBK1 P-S172 KIT - 50K PTS

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概述

基于磷酸化 TBK1 的细胞检测试剂盒可便捷、准确地定量 Ser172 位点磷酸化的 TBK1。在病原体感染后，TBK1 可被细菌脂多糖（LPS）和病原体核酸激活，进而触发 TLR3/4 和 cGAS-STING 信号轴的激活。该磷酸化 TBK1 检测试剂盒适用于从基础研究到临床前药物发现的各个阶段，且包含实验所需的全部物品。与酶联免疫吸附试验（ELISA）/ 蛋白质印迹法（WB）相比，其检测通量更高。

工作原理

磷酸化 TBK1（Ser172）检测原理

磷酸化 TBK1（Ser172）检测旨在测定 Ser172 位点磷酸化的 TBK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则可识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接相关，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 TBK1 双板检测方案

双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 TBK1（Ser172）HTRF 检测试剂。通过该方案可监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 TBK1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 Ser172 位点磷酸化的 TBK1 时，可在同一培养板中完成细胞培养、刺激和裂解步骤，无需洗涤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案在实现微型化的同时，仍能保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

分析 TBK1 磷酸化以监测枯否细胞中 LPS/TLR4 轴的活性

将小鼠枯否细胞（ImKC 细胞系）接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养。次日，用含不同浓度 LPS 的无血清培养基处理细胞 1 小时。移除培养基后，加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，随后将 16 µL 裂解液分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，LPS 可激活 TLR4 信号，使 Ser172 位点的 TBK1 磷酸化水平提高 3 倍，而激酶的表达水平保持稳定，表明 LPS 无细胞毒性作用。

分析 TBK1 磷酸化以监测 cGAS-STING 通路的激活

将小鼠枯否细胞（ImKC 细胞系）接种到 96 孔板中（200,000 个细胞 / 孔），使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养。次日，用含不同浓度 23-cGAMP 的无血清培养基处理细胞 1 小时。移除培养基后，加入 50 µL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，随后将 16 µL 裂解液分两次转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® 磷酸化 TBK1 或总 TBK1 检测抗体。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。结果显示，用 23-cGAMP 处理细胞可激活 STING，进而使 Ser172 位点的 TBK1 磷酸化水平提高 3.6 倍，且激酶的表达水平如预期保持稳定。

HTRF 磷酸化及总 TBK1 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人宫颈癌细胞系 HeLa 接种到 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天，直至细胞汇合度达到 90%。随后用 200 nM 花萼海绵诱癌素 A 处理细胞 10 分钟，加入 3 mL 补充的 4 号裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF® 磷酸化或总 TBK1 检测抗体。取等量裂解液分别进行 HTRF 检测和蛋白质印迹法检测以作对比。结果显示，使用 HTRF® 磷酸化或总 TBK1 试剂盒时，每孔仅需 1,250 个细胞即可检测到显著信号，而蛋白质印迹法至少需要 2,500 个细胞才能检测到最小的电化学发光（ECL）信号。因此，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

简化通路

TLR3/4 和 cGAS-STING 简化通路

TBK1（TANK 结合激酶 1，又称 NAK）是一种多聚体激酶，通过 Ser172 位点的自身磷酸化被激活。该激酶是炎症和自噬相关多个通路之间的关键信号节点。在病原体感染后，TBK1 可被细菌 LPS 和病原体核酸激活，从而触发 TLR3/4 和 cGAS-STING 信号轴的激活。当 LPS 与细胞表面的 TLR4 结合后，受体转移至内体并招募 TRAM 蛋白，进而激活 TRIF 蛋白。同理，进入细胞的双链 RNA（dsRNA）与内体中的 TLR3 结合，直接激活 TRIF。对于双链 DNA（dsDNA），其进入细胞后与胞质传感器 cGAS 结合，诱导产生 23-cGAMP，进而激活衔接蛋白 STING。上述每条通路被激活后，TBK1 会被招募到不同的信号复合物中，并通过 Ser172 位点的自身磷酸化被激活。随后，该激酶激活转录因子 IRF3，IRF3 转移至细胞核并诱导 I 型干扰素基因的表达，引发炎症反应。TBK1 还参与自噬过程，它可直接磷酸化自噬受体视神经萎缩蛋白（optineurin）和 p62，这些受体将蛋白质 cargo 靶向运输至自噬体。

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64TBKPEY

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