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HTRF (H/M) TDP43 P-S409 KIT - 500 PTS

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品牌： Revvity

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概述

TAR DNA 结合蛋白 43（TDP-43）是一种参与 RNA 相关代谢的核酸结合蛋白。TDP-43 聚集体已被确认为肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的标志性物质，更广泛地说，它也是多种神经退行性疾病（即 TDP-43 蛋白病）的标志。在病理状态下（如基因突变或调控异常），TDP-43 会在大脑和脊髓神经元的细胞质中形成不溶性包涵体。本 TDP-43 磷酸化检测可对细胞裂解液中的人源磷酸化 TDP-43 进行检测。

作用原理

TDP-43 磷酸化检测原理

TDP-43 磷酸化检测可对 Ser409/410 位点磷酸化的 TDP-43 进行定量分析。与蛋白质印迹法不同，该检测为全板基操作，无需使用凝胶、进行电泳或转膜。该检测采用两种抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。其中，第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则可识别蛋白质本身（与蛋白质是否磷酸化无关）。当蛋白质发生磷酸化时，会形成由两种标记抗体共同参与的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团近距离接触，进而产生荧光共振能量转移信号。该信号的强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度呈直接正相关，且可在免洗涤检测模式下评估蛋白质的磷酸化状态。

（标注：Assay principle phospho tdp，即 “TDP-43 磷酸化检测原理示意图”）

TDP-43 磷酸化双板检测方案

双板检测方案的操作流程如下：先在 96 孔板中培养细胞，随后对细胞进行裂解；将裂解液转移至 384 孔小体积检测板中，再加入 TDP-43 磷酸化 HTRF 检测试剂。该方案可同时监测细胞的活力与汇合度。

（标注：Tdp 43 phospho，即 “TDP-43 磷酸化双板检测方案流程示意图”）

TDP-43 磷酸化单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测 TDP-43 磷酸化时，可在同一块培养板中完成细胞培养、刺激与裂解操作，无需洗涤步骤。该方案为高通量筛选设计，既能实现实验微型化，又能保持 HTRF 技术的高稳定性。

（标注：Assay protocol phospho tdp phospho，即 “TDP-43 磷酸化单板检测方案流程示意图”）

检测详情

利用花萼海绵诱癌素 A 调控 TDP-43 磷酸化水平

将 Neuro2a 细胞接种到 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），培养 24 小时后，用不同浓度的花萼海绵诱癌素 A（一种蛋白磷酸酶 1 和 2A 抑制剂）处理 30 分钟。处理完成后，按照悬浮细胞检测方案的说明，加入 10 微升补充型 1 号裂解缓冲液（4 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

裂解完成后，将 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 磷酸化或总 TDP-43 检测抗体。在室温下孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果与预期一致：花萼海绵诱癌素 A 通过抑制 PP1/2，以剂量依赖的方式诱导 Ser409/410 位点磷酸化 TDP-43 的积累，而该处理对 TDP-43 蛋白的表达水平无调控作用。

（标注：Assay validation phospho tdp activator，即 “花萼海绵诱癌素 A 调控 TDP-43 磷酸化检测结果图”）

利用 CK1 抑制剂抑制 TDP-43 磷酸化

将 Neuro2a 细胞接种到 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），培养 24 小时后，先用 CK1 抑制剂 IC 261 或 PF 670462（浓度均为 100 微摩尔 / 升）处理 1.5 小时，再用花萼海绵诱癌素 A（浓度 100 纳摩尔 / 升）激活 30 分钟。

细胞裂解后，将 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 微升 HTRF TDP-43 磷酸化或总 TDP-43 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果与预期一致：经 CK1 抑制剂处理后，花萼海绵诱癌素 A 诱导的 TDP-43 Ser409/410 位点磷酸化被抑制，而该处理对 TDP-43 蛋白的表达水平无调控作用。

（标注：Assay validation phospho tdp inhibitor，即 “CK1 抑制剂抑制 TDP-43 磷酸化检测结果图”）

在星形孢菌素诱导的聚集体模型中检测磷酸化 TDP-43 的准确水平

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（每孔 50,000 个细胞），培养 24 小时后，用 1 微摩尔 / 升的星形孢菌素（一种公认的胱天蛋白酶激活剂，可切割 TDP-43 并诱导其 C 端片段聚集）处理 6 小时。处理完成后，移除细胞培养基，加入 50 微升补充型 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

裂解完成后，将相同处理条件下的 3 个孔的裂解液合并，然后按照方案说明，用蛋白解聚试剂盒（Revvity 货号：64DAGGRPET）对每种条件下的 2 份 60 微升裂解液进行解聚处理。

确认解聚步骤完成后，将 16 微升各处理组的裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 磷酸化检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果与预期一致：星形孢菌素诱导的 TDP-43 聚集会导致其 Ser409/410 位点磷酸化水平升高，且该升高仅在解聚处理后可被检测到。

这些结果不仅证明蛋白解聚试剂盒与 HTRF 磷酸化检测具有兼容性，还提示需通过该解聚流程才能更准确地检测聚集态 TDP-43 的磷酸化水平。

（标注：Assay validation phospho tdp aggregates detection，即 “聚集体模型中磷酸化 TDP-43 检测结果图”）

评估不同细胞系中 TDP-43 磷酸化水平

将贴壁生长的人源和鼠源细胞（Neuro2A 细胞、HeLa 细胞、SH-SY5Y 细胞）以每孔 50,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用 100 纳摩尔 / 升的花萼海绵诱癌素 A 处理细胞 30 分钟。处理完成后，按照悬浮细胞检测方案的说明，加入 10 微升补充型 1 号裂解缓冲液（4 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

裂解完成后，将 16 微升裂解液转移至 384 孔小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 磷酸化检测试剂。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

结果显示：HTRF TDP-43 磷酸化检测可在人源和鼠源细胞模型中有效检测到磷酸化 TDP-43，且相同处理后不同细胞系的磷酸化水平存在差异。

（标注：Assay validation phospho tdp assay versatility，即 “不同细胞系中 TDP-43 磷酸化检测结果图”）

HTRF TDP-43 磷酸化检测与蛋白质印迹法的对比

将 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，用完全培养基在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养。孵育 48 小时后，用花萼海绵诱癌素 A（浓度 100 纳摩尔 / 升）处理细胞 30 分钟，随后加入 3 毫升补充型 1 号裂解缓冲液（1 倍浓度），在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟。

用补充型裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，将 16 微升各稀释度的裂解液转移至小体积白色微孔板中，再加入 4 微升 HTRF TDP-43 磷酸化检测试剂。取等量裂解液进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行对比。

结果显示：使用 HTRF TDP-43 磷酸化检测时，每孔仅需 4000 个细胞即可检测到显著信号；而使用蛋白质印迹法时，需 16,000 个细胞才能检测到最低化学发光信号。因此，在此实验条件下，HTRF TDP-43 磷酸化检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

（标注：Assay validation phospho tdp wb comparison，即 “HTRF 与 Western Blot 检测 TDP-43 磷酸化对比结果图”）

简化通路

TDP-43 检测相关信号通路

TDP-43 是一种 DNA 和 RNA 结合蛋白，在 RNA 代谢中发挥关键作用。它主要定位于细胞核内，同时也会在细胞核与细胞质之间穿梭。

TDP-43 的磷酸化受到调控，尽管在病理状态下其磷酸化过程可能出现异常。已知多种激酶可促进 TDP-43 的磷酸化，包括酪蛋白激酶、Tau 微管蛋白激酶以及细胞分裂周期蛋白 7；而磷酸酶和钙调磷酸酶则可催化 TDP-43 的去磷酸化。基因突变、氧化应激等因素导致的上述调控过程异常，可能会使 TDP-43 磷酸化水平升高。TDP-43 的磷酸化会影响其细胞功能（如 RNA 结合或选择性剪接），还可能导致其定位异常并在细胞质中积累，进而引发聚集体形成。

在病理状态下，Ser409/410 位点磷酸化的 TDP-43 是多种蛋白病的标志，如肌萎缩侧索硬化症、额颞叶痴呆或阿尔茨海默病。TDP-43 的异常磷酸化、细胞质积累及聚集会阻碍蛋白酶体和自噬机制对其的清除，最终导致神经元毒性。

TDP-43 的磷酸化及其调控机制，或可为神经退行性疾病的治疗提供新的方向。

（标注：pathway-phospho-TDP-43-64tdps4peg-64tdps4peh-64tdps4pey.svg，即 “TDP-43 磷酸化相关信号通路简化示意图”）

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF（均相时间分辨荧光）
裂解缓冲液兼容性：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16 微升
运输条件：干冰运输
靶点类别：磷酸化蛋白
靶点物种：人、小鼠
技术平台：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64TDPS4PEG

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