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HTRF (H) TFEB P-S211 KIT - 50K PTS

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概述

TFEB 作为巨自噬的上游调节因子，巨自噬是维持细胞内稳态的生理过程。这使得 TFEB 成为多种疾病（与衰老相关的疾病、感染性疾病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症）的新治疗靶点。

工作原理

磷酸化 TFEB（Ser211）检测原理

磷酸化 TFEB（Ser211）检测用于测量在 Ser211 位点发生磷酸化的 TFEB。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用无需洗涤的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了一种方法。

磷酸化 TFEB 检测原理

磷酸化 TFEB（Ser211）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板中，之后添加磷酸化 TFEB（Ser211）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 TFEB 检测方案及工作原理

磷酸化 TFEB（Ser211）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 TFEB（Ser211）可在单个板中完成，该板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用 mTOR 抑制剂抑制 TFEB Ser211 磷酸化

将 HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂ 条件下过夜孵育。随后，用不同浓度的 mTOR 抑制剂（AZD2014 或 PP242）在 37°C、5% CO₂ 条件下处理细胞 1 小时。用 50 µL 补充的 #4 裂解缓冲液裂解细胞后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

正如预期，我们的结果显示，经 mTOR 抑制剂处理后，Ser211 位点磷酸化的 TFEB 呈剂量依赖性减少，而 TFEB 的总表达水平未受到显著调控。此外，在相同实验条件下，通过 ATPlite™ 检测（Revvity，#601673）未观察到细胞毒性效应（数据未显示）。

利用 siRNA 评估磷酸化 TFEB（Ser211）试剂盒的特异性

将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞）并培养 24 小时。然后用 TFEB 特异性小干扰 RNA（siRNA）以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞并将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，随后添加 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测抗体。

与转染阴性对照 siRNA 的细胞相比，转染 TFEB siRNA 的细胞信号降低了 90%。在相同实验条件下，通过 ATPlite™ 检测评估发现，沉默 TFEB 对细胞增殖或活力无影响。

这些结果证实了 HTRF 磷酸化 TFEB（S211）试剂盒的检测特异性。

不同人类细胞系中磷酸化 TFEB（Ser211）的检测

使用 HTRF 磷酸化 TFEB（Ser211）试剂盒在多种细胞系（THP1、HeLa、HEK293T 和 U87-MG）中评估磷酸化 TFEB（Ser211）的表达水平。

这些细胞系在 T175 培养瓶中使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。将 16 µL 各裂解物转移至小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（Ser211）检测试剂。

HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测与蛋白质印迹法的比较

将 THP1 细胞在 T175 培养瓶中使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液转移至小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测试剂。使用等量的裂解物进行 HTRF 检测与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 磷酸化 TFEB（S211）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

简化通路

TFEB 信号通路

TFEB（转录因子 EB）是属于 MiTF/TFE 家族的转录因子。TFEB 通过在 96 个以上溶酶体基因启动子中存在的共有序列（CLEAR 基序 —— 协调溶酶体表达与调控基序），诱导编码自噬和溶酶体生物发生相关蛋白质的基因转录。

TFEB 的活性受磷酸化事件调控，这些磷酸化由不同的激酶介导，包括 AKT、mTOR 和 ERK2。

在营养丰富的条件下，TFEB 在 Ser211 位点被 mTOR 磷酸化，并被隔离在细胞质中；而在饥饿或溶酶体功能障碍时，TFEB 去磷酸化并转移到细胞核中，从而促进基因转录。

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64TFEBS2PEY

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