HTRF (H) TFEB TOTAL KIT - 50K PTS

概述

工作原理

• 总 TFEB 检测原理
  HTRF 总 TFEB 检测用于定量 TFEB 的表达水平，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转移步骤。检测使用两种抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体偶联。这两种抗体对蛋白质上的不同表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 TFEB 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且提供了一种在无需洗涤的检测格式下评估蛋白质表达的方法。
• 总 TFEB 双板检测方案
  双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加总 TFEB HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
• 总 TFEB 单板检测方案
  使用 HTRF 试剂检测总 TFEB 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

• 使用 mTOR 抑制剂抑制 TFEB Ser211 磷酸化过程中对总 TFEB 的监测
  将 HeLa 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂ 条件下过夜孵育。然后，用不同浓度的 mTOR 抑制剂（AZD2014 或 PP242）在 37°C、5% CO₂ 条件下处理细胞 1 小时。用 50 µL 补充的 #4 裂解缓冲液裂解细胞后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 TFEB 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

• 通过 siRNA 评估总 TFEB 试剂盒的特异性
  将 HeLa 细胞接种到 96 孔板中（每孔 20,000 个细胞）并培养 24 小时。然后用 TFEB 特异性 siRNA 以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 TFEB 检测抗体。

• 多种人类细胞系中的总 TFEB 检测
  使用 HTRF 总 TFEB 试剂盒在不同细胞系（THP1、HeLa、HEK293T 和 U87-MG）中评估总 TFEB 的表达水平。

• HTRF 总 TFEB 检测与蛋白质印迹法的比较
  THP1 细胞在 T175 培养瓶中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂ 条件下培养。孵育 48 小时后，用 3 mL 补充的 #4 裂解缓冲液（1X）在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

简化通路

• TFEB 信号通路
  TFEB（转录因子 EB）是一种属于 MiTF/TFE 家族的转录因子。TFEB 通过在超过 96 个溶酶体基因启动子中存在的共有序列（CLEAR 基序 —— 协调溶酶体表达和调控）诱导编码与自噬和溶酶体生物发生相关蛋白质的基因转录。

规格

• 应用：细胞信号传导
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 裂解缓冲液兼容性：
  • 裂解缓冲液 1
  • 裂解缓冲液 2
  • 裂解缓冲液 3
  • 裂解缓冲液 4
• 分子修饰：总（蛋白）
• 产品类别：试剂盒
• 样品体积：16 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：磷蛋白
• 靶标物种：人类
• 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
• 单位规格：500 个检测点