HTRF 磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)细胞检测试剂盒是定量内源性在丝氨酸 202 / 苏氨酸 205 位点磷酸化的磷酸化 - TAU 的理想工具。
在阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)中,TAU 存在不同状态。TAU 的过度磷酸化也是多种神经退行性疾病和中枢神经系统 disorders 的标志物。
磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)检测用于测量在 Ser202/Thr205 位点发生磷酸化的 TAU。与蛋白质印迹法不同,该检测完全基于微孔板进行,无需凝胶、电泳或转膜步骤。
磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)检测使用两种标记抗体:一种带有供体荧光团,另一种带有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序,第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物,使供体荧光团与受体荧光团靠近,从而产生荧光共振能量转移(FRET)信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比,且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。
双板方案包括:先在 96 孔板中培养细胞,然后裂解细胞,再将裂解物转移至 384 孔小体积检测板,之后加入磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)HTRF 检测试剂。
该方案能够监测细胞活力和汇合度。
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)可在单个培养板中完成,该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。
这种为高通量筛选(HTS)设计的方案可实现微型化,同时保持稳定的 HTRF 检测质量。
将 50,000 个人类 SH-SY5Y 细胞接种到 96 孔板中,在 37°C、5% CO₂条件下孵育 72 小时。
用浓度递增的 GSK3 抑制剂(CHIR99021 和 BIO)孵育 3 小时后,移除培养基,加入 50µl 裂解缓冲液,在室温下轻轻摇晃,裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物转移至 384 孔白色微量板中,加入 4µL HTRF 磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)检测试剂。
过夜孵育后记录 HTRF 信号。
将 50,000 个人类 SH-SY5Y 细胞接种到 96 孔板中,在 37°C、5% CO₂条件下孵育 72 小时。移除培养基,加入 50µl 裂解缓冲液,在室温下轻轻摇晃,裂解细胞 30 分钟。
加入碱性磷酸酶(25U)和适当的缓冲液,1 小时后移除。将 16µL 裂解物转移至 384 孔白色微量板中,加入 4µL HTRF 磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。
将 50,000 个人类 SH-SY5Y 细胞接种到 96 孔板中,在 37°C、5% CO₂条件下孵育 72 小时。然后用 GSK3 抑制剂 BIO 处理 SH-SY5Y 细胞 3 小时。移除细胞培养基后,加入 50µl 裂解缓冲液,在室温下轻轻摇晃,裂解细胞 30 分钟。将 16µL 裂解物转移至 384 孔白色微量板中,加入 4µL HTRF 磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)和 α- 微管蛋白检测试剂。
过夜孵育后记录 HTRF 信号。
将人类 SH-SY5Y 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养至 80% 汇合度。弃去细胞培养基,加入 3mL 补充的裂解缓冲液,在室温下孵育 30 分钟以裂解细胞。离心 10 分钟后收集可溶性组分。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释,然后取 16µL 每种稀释液,分别通过蛋白质印迹法和 HTRF 进行平行分析。
使用 HTRF 磷酸化 - TAU(Ser202/Thr205)细胞检测试剂盒,仅需 2,500 个细胞即可检测到最小信号,而蛋白质印迹法则需要 5,000 个细胞。HTRF 细胞检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 2 倍。
TAU 在阿尔茨海默病的发病机制中起着重要作用。它会发生过度磷酸化并聚集形成细丝,这些细丝还可进一步浓缩成神经原纤维缠结。TAU 聚集体可能通过类似朊病毒的方式在细胞间传播,从而加剧病理过程。调节 TAU 过度磷酸化并减少 TAU 聚集的药物是可行的治疗方法。
TAU 蛋白的生理作用是促进微管的组装和稳定。目前已发现 TAU 有 6 种异构体,其氨基酸残基数从 352 到 441 不等,这些异构体来自外显子 2、3 和 10 的选择性剪接。TAU 最长的异构体(TAU-441)含有 85 个潜在的磷酸化位点,其中一半已通过实验得到证实。
- 应用领域:细胞信号传导
- 品牌:HTRF
- 检测方式:HTRF
- 兼容裂解缓冲液:裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
- 分子修饰:磷酸化
- 产品类别:试剂盒
- 样品体积:16µL
- 运输条件:干冰运输
- 靶标类别:磷酸化蛋白
- 靶标物种:人类
- 技术:时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)
- 治疗领域:神经科学
- 单位规格:10,000 次检测点数