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HTRF UBIQUITIN P-S65KIT - 50K PTS

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概述

磷酸化泛素（Ser65）细胞检测试剂盒旨在监测泛素链磷酸化形式的水平。泛素本身是一种含 76 个氨基酸的蛋白质（分子量 8.5 kDa），表达广泛且高度保守，在人类和小鼠中具有 100% 的氨基酸序列同一性。

泛素的磷酸化是通过 Parkin/PINK-1 相互作用实现线粒体质量控制过程中的关键步骤。Parkin 是一种泛素连接酶 E3，可将泛素偶联到受损的线粒体蛋白上，进而导致细胞器降解。PINK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，仅在受损的线粒体上积累，并能磷酸化两种底物，即 Parkin 的泛素样结构域和泛素链。

经放大的 Parkin/PINK-1 依赖性泛素功能可作为受损线粒体（线粒体自噬）的隔离和降解信号。该信号通路的失调与某些形式的帕金森病相关。

解偶联剂（如 CCCP 和缬氨霉素）引起的线粒体去极化会导致 PINK1 在 mitochondrial outer membrane 上积累，并触发 Ser65 磷酸化泛素的产生。

工作原理

磷酸化泛素（Ser65）检测原理
磷酸化泛素（Ser65）检测用于测量在 Ser65 位点发生磷酸化的泛素。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转移步骤。检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且提供了一种在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质磷酸化状态的方法。
磷酸化泛素（Ser65）双板检测方案
双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后添加激活缓冲液和磷酸化泛素（Ser65）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。
磷酸化泛素（Ser65）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化泛素（Ser65）可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

人神经细胞系的 CCCP 刺激曲线
将神经母细胞瘤（人）细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。

次日，更换培养基，用不同浓度的线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）在 37°C、5% CO₂条件下孵育细胞 6 小时。移除培养基后，用 50µL 1X 补充的 #1 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 14µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，先添加 2µL 激活缓冲液，再添加 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测抗体。

同时对 4µL 1:4 稀释的裂解物进行 HTRF 微管蛋白检测，作为归一化工具。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在神经细胞中，CCCP 可促进泛素在 Ser65 位点的磷酸化。其半数有效浓度（EC50）与报道值一致。微管蛋白检测表明，在此浓度范围内不存在 CCCP 毒性问题。

小鼠 Neuro-2A 细胞系的 CCCP 刺激曲线
将 Neuro-2A（小鼠）细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，按照上述神经细胞的处理方法用 CCCP 刺激。然后将 14µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，先添加 2µL 激活缓冲液，再添加 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测抗体。同时对 4µL 未稀释的裂解物进行 HTRF 微管蛋白检测。

过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 Neuro-2A 细胞中，CCCP 可促进泛素在 Ser65 位点的磷酸化。其 EC50 在微摩尔范围内，与神经细胞中观察到的值相近。

人神经细胞系的缬氨霉素刺激曲线
将神经（人）细胞以每孔 200,000 个细胞的密度接种到 96 孔板中，在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下过夜培养。

次日，更换培养基，用不同浓度的线粒体解偶联剂缬氨霉素在 37°C、5% CO₂条件下孵育细胞 4 小时。移除培养基后，用 50µL 1X 补充的 #1 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 14µL 裂解物转移到小体积白色微孔板中，先添加 2µL 激活缓冲液，再添加 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测抗体。过夜孵育后记录 HTRF 信号。在神经细胞中，缬氨霉素可促进泛素在 Ser65 位点的磷酸化，其 EC50 在纳摩尔范围内。

HTRF 磷酸化泛素（Ser65）检测与蛋白质印迹法的比较
将人神经细胞接种到 T175 培养瓶的完全培养基中，用 10µM CCCP 在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时。然后用 3mL 补充的 #1 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。

用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 14µL 每种稀释液转移到 384 孔小体积白色微孔板中，先添加 2µL 激活缓冲液，再添加 4µL HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测试剂。使用等量的裂解物对蛋白质印迹法和 HTRF 检测进行平行比较。

该结果表明，至少在这些实验条件下，HTRF 泛素磷酸化 - S65 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

在去极化诱导的线粒体自噬过程中，与线粒体外膜相连的 PINK1（PTEN 诱导激酶 1）通过二聚化和自磷酸化被激活。激活后的 PINK-1 可磷酸化泛素连接酶 Parkin 其泛素样结构域的 Ser65 位点。PINK-1 还能磷酸化与线粒体外膜蛋白相连的多聚泛素链的 Ser65 位点。产生的 Ser65 磷酸化泛素作为关键信号，招募线粒体蛋白以启动线粒体自噬。

规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：
- 人类
- 小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：神经科学
单位规格：50,000 个检测点

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货号：64UBIS65PEY

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