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HTRF ULK1 P-S758 KIT - 500 PTS

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概述

这种基于细胞的磷酸化 ULK1 检测旨在监测 ULK1 在小鼠丝氨酸 757（Ser757）或人类丝氨酸 758（Ser758）位点的磷酸化水平变化。ULK1 的磷酸化是自噬（即细胞 “自食” 过程）的标志性事件。

工作原理

磷酸化 ULK1（小鼠 Ser757 / 人类 Ser758）检测原理

磷酸化 ULK1（小鼠 Ser757 / 人类 Ser758）检测用于测量在小鼠 Ser757 或人类 Ser758 位点发生磷酸化的 ULK1。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用 “无需洗涤” 的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。

磷酸化 ULK1（小鼠 Ser757 / 人类 Ser758）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，最后加入磷酸化 ULK1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 ULK1（小鼠 Ser757 / 人类 Ser758）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ULK1 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

基于磷酸化 ULK1 细胞检测的 HTRF 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 人胚肾细胞培养 2 天，直至达到 80% 汇合度。然后用补充的裂解缓冲液裂解细胞，通过离心收集可溶性上清液。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将其转移到 384 孔小体积白色微孔板中，最后加入 HTRF 磷酸化 ULK1 试剂盒试剂。蛋白质印迹法与 HTRF 检测的平行比较表明，HTRF 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

使用 mTOR 抑制剂 Torin 1 上调 MCF-7 人乳腺癌细胞中的自噬

将 MCF-7 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的 Torin 1 处理细胞 5 小时后，移除培养基，加入 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 ULK1（Ser758）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

使用 PI3K 抑制剂渥曼青霉素（Wortmannin）上调 HEK293 人胚肾细胞中的自噬

将 HEK293 细胞以 50,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。用不同浓度的渥曼青霉素处理细胞 5 小时后，移除培养基，加入 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 ULK1（Ser758）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

使用胰岛素下调 MCF-7 人乳腺癌细胞中的自噬

将 MCF-7 细胞以不同密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。经过 3 小时的血清饥饿处理后，用 200nM 胰岛素处理细胞 30 分钟。然后移除培养基，加入 50µL 补充的 #4 裂解缓冲液，在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 磷酸化 ULK1（Ser758）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

简化通路

ULK1 激酶复合物的功能与调控

ULK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，可与 Atg13 和 FIP200 蛋白形成复合物。该复合物是核心自噬机制中最上游的组件，因此是哺乳动物细胞自噬的关键启动因子。ULK1 受关键的营养 / 能量敏感激酶 mTOR 和 AMPK 调控，这两种激酶均能磷酸化 ULK1 并直接调节其激酶活性。

规格参数

项目	详情
应用领域	细胞信号传导
品牌	HTRF
检测方式	HTRF（均相时间分辨荧光）
兼容的裂解缓冲液	裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰	磷酸化
产品类别	试剂盒
样品体积	16µL
运输条件	干冰运输
靶标类别	磷酸化蛋白
靶标物种	人
技术原理	TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
治疗领域	心血管疾病、传染病、代谢 / 糖尿病、神经科学、肿瘤与炎症
单位规格	500 个检测点

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