HTRF (H) ULK1 P-S556 KIT - 10K PTS

概述

ULK1是一种胞质激酶，是一个复合物的组成部分，作为巨自噬的上游调节因子，可促进吞噬泡的形成。自噬是维持细胞内稳态的生理过程，这使得ULK1成为多种疾病（与衰老相关的疾病、传染病、溶酶体贮积症、神经退行性疾病或癌症）的新治疗靶点。工作原理

HTRF磷酸化ULK1（Ser556）检测原理 磷酸化ULK1（Ser556）检测用于测量在Ser556位点发生磷酸化的ULK1。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测中使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能够不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且该检测采用“无需洗涤”的形式，为评估蛋白质的磷酸化状态提供了便利。 磷酸化ULK1（S556）双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移到384孔小体积检测板中，最后加入磷酸化ULK1（Ser556）HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。 磷酸化ULK1（Ser556）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化ULK1（Ser556）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的HTRF检测质量。 检测验证

在不同细胞系中使用AMPK抑制剂抑制ULK1 Ser556磷酸化 将U-87 MG或MCF7细胞接种到96孔培养处理板中，每孔100,000个细胞，加入完全培养基，在37°C、5%CO₂条件下孵育过夜。然后用浓度递增的AMPK抑制剂（BAY-3827）处理细胞1小时（37°C、5%CO₂）。用25µL补充的4裂解缓冲液裂解细胞后，将16µL裂解物转移到384孔小体积白色微孔板中，随后加入4µL HTRF磷酸化（S556）ULK1检测抗体。室温孵育过夜后记录HTRF信号。 正如预期，我们的结果显示，经AMPK抑制剂处理后，Ser556位点磷酸化的ULK1呈剂量依赖性减少，而总ULK1的表达水平未受到显著调节。此外，在相同实验条件下，使用GAPDH管家细胞试剂盒（Revvity®，货号64GAPDHPEG）未观察到细胞毒性作用（数据未显示）。 磷酸化S556 ULK1检测的特异性 使用HTRF磷酸化S556 ULK1试剂盒在不同的HAP1细胞系中评估磷酸化S556 ULK1的表达水平。 将HAP1野生型（HAP1 WT）和ULK1敲除的HAP1（HAP1 KO ULK1）细胞系在T175培养瓶中用完全培养基于37°C、5%CO₂条件下培养。孵育48小时后，对于30×10⁶个细胞，加入1mL补充的#4裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。 将16µL每种裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入4µL HTRF磷酸化（S556）ULK1检测试剂。 使用多种人类细胞系的磷酸化S556 ULK1检测的通用性 - 使用HTRF磷酸化S556 ULK1试剂盒在不同细胞系（U-87 MG、MCF7、HeLa）中评估磷酸化S556 ULK1的表达水平。 这些不同的细胞系在T175培养瓶中用完全培养基于37°C、5%CO₂条件下培养。孵育48小时后，对于30×10⁶个细胞，加入1mL补充的#4裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。 将16µL每种裂解物转移到小体积白色微孔板中，随后加入4µL HTRF磷酸化S556 ULK1检测试剂。 HTRF磷酸化S556 ULK1检测与蛋白质印迹法的比较 将U-87 MG细胞在T175培养瓶中用完全培养基于37°C、5%CO₂条件下培养。孵育48小时后，对于30×10⁶个细胞，加入1mL补充的#4裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡30分钟裂解细胞。 用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将16µL各稀释液转移到小体积白色微孔板中，随后加入4µL HTRF磷酸化S556 ULK1检测试剂。使用等量的裂解物进行HTRF检测与蛋白质印迹法的平行比较。 在这些条件下，HTRF磷酸化S556 ULK1检测的灵敏度是蛋白质印迹技术的8倍。 简化通路

ULK1信号通路 ULK1是一种胞质激酶，是包含FIP200、Atg101和Atg13的ULK1复合物的一部分。ULK复合物的激活会促进吞噬泡的形成和自噬的启动。 ULK1复合物受到mTORC1的负调控，而AMPK介导其激活。mTORC1通过直接磷酸化ULK1上的Ser758来抑制ULK1复合物。在营养饥饿条件下，AMPK通过在Ser317和Ser556位点磷酸化激活ULK1，或通过抑制mTORC1来促进自噬。 ULK1复合物被认为是自噬的上游枢纽，自噬是维持细胞内稳态的生理过程。这使得ULK1成为治疗靶点，特别是在癌症治疗中。例如，ULK1抑制可诱导非小细胞肺癌（NSCLC）细胞凋亡。 规格参数

其他规格 - 应用领域：细胞信号传导 - 品牌：HTRF - 检测方式：HTRF - 兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液1、裂解缓冲液4 - 分子修饰：磷酸化 - 产品类别：试剂盒 - 样品体积：16µL - 运输条件：干冰运输 - 靶标类别：磷酸化蛋白 - 靶标物种：人类 - 技术原理：TR-FRET - 单位规格：10,000个检测点