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HTRF (H/M) WEE1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

Wee1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在细胞周期调控中发挥重要作用。为应对 DNA 损伤，Wee1 的活性会被上调，从而促使细胞周期停滞。Wee1 通过磷酸化使 Cdk1 失活，以此调控 G2/M 细胞周期检查点。在 S 期，Wee1 对 Cdk2 进行磷酸化，防止细胞进入下一个细胞周期阶段，直至 DNA 复制或修复完成。Wee1 在多种癌症中存在过表达现象，且与癌症患者无病生存期较短相关。因此，对 Wee1 的抑制是一个活跃的研究领域，尤其是在蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）这一新方法出现之后。

工作原理

总 Wee1 检测原理

总 Wee1 检测可对细胞裂解物中 Wee1 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 Wee1 检测使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。这两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 Wee1 时，添加这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，进而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤就能评估蛋白质的表达水平。

检测原理

总 Wee1 双板检测方案

双板方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再添加总 Wee1 HTRF 检测试剂。此方案能够监测细胞的活力和汇合度。

检测方案

总 Wee1 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 Wee1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

PROTAC® 诱导的 Wee1 降解

将人胚肾 293（Hek 293）细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。

移除细胞培养基后，用不同浓度的 PROTAC 化合物 ZNL-02-096 以及用于 PROTAC 合成的 Wee1 抑制剂 AZD-1775（作为对照）处理细胞。作为对照，在添加 PROTAC 之前，将细胞与蛋白酶体抑制剂环氧霉素（Epoxomicin）在 37°C 下预孵育 1 小时。

孵育 4 小时后，移除细胞培养基，向每个孔中加入 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4 µL HTRF Wee1 检测抗体。另外，将 4 µL 裂解物（补充有 12 µL 稀释剂 #8）也转移到微孔板中，以便使用 α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPET/G/H）监测 α- 微管蛋白水平。孵育过夜后，记录两个试剂盒的 HTRF 信号。

ZNL-02-096 PROTAC 引发了 Wee1 蛋白的剂量依赖性减少，其 DC50* 为 0.41nM，而特异性 Wee1 抑制剂 AZD-1775 则未产生此效果。在环氧霉素存在的情况下，未观察到 Wee1 的减少，这表明降解是由泛素 - 蛋白酶体系统驱动的。在相同实验条件下，所测的 α- 微管蛋白水平保持不变。

*DC50 指降解剂使 50% 的靶蛋白降解时的浓度。

使用 siRNA 验证总 Wee1 检测的特异性

将 Hek293 细胞以每孔 20,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。然后用针对 Wee1 或 Wee2 的特异性小干扰 RNA（siRNA）以及阴性对照 siRNA 转染细胞。孵育 48 小时后，裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

与转染阴性 siRNA 的细胞相比，转染 Wee1 siRNA 的细胞信号降低了 80%。而转染 Wee2 siRNA 的细胞未观察到信号降低。在相同实验条件下，通过 ATPlite™ 检测所测的 ATP 水平表明，未观察到细胞毒性效应。

使用多种细胞系验证总 Wee1 检测的通用性

将贴壁的人类细胞（Hek 293、Hela、HepG2、A431）和小鼠 NIH3T3 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养板中。孵育 24 小时后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后添加 4 µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

HTRF 总 Wee1 检测能够有效检测多种人类和小鼠细胞模型中的 Wee1。

HTRF 总 Wee1 检测与蛋白质印迹法的比较

将 HEK293 细胞在 T175 培养瓶中的完全培养基中培养，在 37°C、5% CO₂ 条件下达到汇合状态。

移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和每个稀释后的样品转移到 384 孔小体积微孔板中，然后添加 4µL HTRF 总 Wee1 检测抗体。孵育过夜后，记录 HTRF 信号。

将等量的裂解物上样到凝胶中，用于 HTRF 与蛋白质印迹法的并列比较。

在这些条件下，HTRF 总 Wee1 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 2 倍。

简化通路

总 Wee1 信号通路

Wee1 是丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族的成员，在细胞周期调控中发挥重要作用。

为确保细胞周期事件的阶段和协同性，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的激活尤为重要。CDK / 细胞周期蛋白复合物调控细胞周期各个阶段的启动和进展，从而控制细胞增殖和凋亡。S 期内以及从 G1 期到 S 期和从 G2 期到 M 期的过渡阶段都可能诱导细胞周期停滞或延迟。

为应对 DNA 损伤，Wee1 的活性会被上调，以促使细胞周期停滞，防止细胞进入下一个细胞周期阶段，直至 DNA 复制或修复完成。

在 G2/M 细胞周期检查点，Wee1 对 Cdk1 的 Tyr15 位点进行磷酸化并抑制其活性。在 S 期，Wee1 对 CDK2 的 Tyr15 位点进行磷酸化。起拮抗作用的磷酸酶 CDC25 会去除这种抑制性磷酸化，从而激活 CDK1 或 CDK2 并促进有丝分裂进入。Wee1 与 CDC25 活性的平衡决定了有丝分裂进入和细胞分裂的时间。

许多癌症存在 G1/S 检查点缺陷，这通常与 p53 突变有关。因此，抑制或降解 Wee1 会导致 G2/M 检查点失效，并能使肿瘤对 DNA 损伤策略敏感。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 1
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64WEE1TPEH

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