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HTRF (H) XBP1S KIT - 500 PTS

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概述

当内质网应激（ER stress）及未折叠蛋白积累时，BiP 会释放其抑制性结合，从而激活 IRE1。IRE1 受体发生二聚化，随后进行自身磷酸化，进而激活其 mRNA 酶活性。通过这一作用，IRE1 将 XBP-1u mRNA 剪接为 XBP1s mRNA，使其能够进行翻译并随后转运至细胞核内。XBP-1s 随后发挥转录因子的作用。

HTRF XBP1s 检测实验可监测剪接后的 XBP1s，用于检测内源性或过表达的 XBP1s 的表达情况。

工作原理

XBP1s 实验原理

HTRF 人源 XBP1 实验可对细胞裂解物中 NRF2 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该实验完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。此 XBP1 实验使用两种标记抗体，一种与供体荧光团偶联，另一种与受体荧光团偶联。两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 XBP1s 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。其强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，并且在无需洗涤的实验形式下，为评估蛋白质的表达提供了一种方法。

实验原理

XBP1 双板实验方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入人源 XBP1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

XBP1 单板实验方案

使用 HTRF 试剂检测人源 XBP1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

实验验证

总 XBP1 和 XBP1s 的药理学验证（激活剂）

将 Hep-G2 或 MCF7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。这些细胞用不同浓度的毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理 4 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。然后用 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 XBP1 和 XBP1s 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，毒胡萝卜素化合物诱导了 XBP1s 形式的翻译，XBP1s 信号水平呈剂量依赖性增加。总 XBP1 信号在该处理下略有增加。

使用抑制剂对 XBP1s 实验进行药理学验证

将 MCF7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用毒胡萝卜素（半数有效浓度 EC80：150nM）和不同浓度的两种抑制剂（APY29 和 MKC3946）共同处理细胞 4 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂。然后用 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF XBP1s 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，由毒胡萝卜素刺激诱导的 HTRF 信号被 APY29 和 MKC3946 化合物有效抑制，其半数抑制浓度（IC50）分别为 1.9µM 和 1.6µM，这意味着在抑制剂存在的情况下，XBP1s 的翻译和表达减少。

XBP1s 实验的特异性

在 T175 培养瓶中过夜孵育后，用 40µg 人源 XBP1s 或 XBP1u 质粒转染 HEK 293T 细胞，然后在完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

用 3mL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF XBP1s 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在转染了 XBP1u 的 HEK293T 细胞裂解物或未转染的细胞裂解物中未检测到信号，而在转染了 XBP1s 的细胞裂解物中检测到强烈信号。这证明了该实验对 XBP1s 蛋白的特异性。

不同细胞系中 XBP1s 的检测

将贴壁的人源和鼠源 HAP1、MCF7 和 Hep-G2 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用毒胡萝卜素在 37°C 下处理细胞 4 小时。然后用补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF XBP1s 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF XBP1s 实验能够有效检测不同细胞模型中表达水平各异的 XBP1s 蛋白。

HTRF XBP1s 实验与蛋白质印迹法的比较

将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 700nM 的毒胡萝卜素化合物处理细胞 4 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂，然后用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF XBP1s 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 和蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF XBP1s 实验的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

XBP1s 通路

XBP1 是未折叠蛋白反应（UPR）的关键组成部分，该反应可调节细胞存活。存在三种未折叠蛋白反应通路，涉及不同的介质，如 ATF6、IRE1 和 PERK，并会产生显著的下游效应。

当发生内质网应激且未折叠蛋白积累时，BiP 会释放其对三种内质网应激蛋白的抑制性结合，并激活它们。

IRE1 被激活后，首先发生二聚化，然后进行自身磷酸化，从而激活其 mRNA 酶活性。通过这一作用，IRE1 将 XBP-1u mRNA 剪接为 XBP1s mRNA，使其能够进行翻译并随后转运至细胞核内。XBP1s 随后发挥转录因子的作用。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：
- 裂解缓冲液 1
- 裂解缓冲液 2
- 裂解缓冲液 3
- 裂解缓冲液 4
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64XBPSTPEG

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