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HTRF (H) XBP1 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

HTRF 人源 XBP1 检测法可监测剪接型 XBP1（XBP1s）和未剪接型 XBP1（XBP1u），用于检测不同细胞中内源性或过表达的总 XBP1（XBP1s + XBP1u）的表达情况。

当内质网应激及未折叠蛋白积累时，BiP 会释放其抑制性结合以激活 IRE1。IRE1 受体发生二聚化，随后发生自身磷酸化，从而激活其 mRNA 酶活性。通过这一作用，IRE1 将 XBP-1u mRNA 剪接为 XBP1s mRNA，使其能够进行翻译并随后转运至细胞核。XBP-1s 随后发挥转录因子的作用。

工作原理

总 XBP1 检测原理
HTRF 人源总 XBP1 检测法可对细胞裂解物中 XBP1（XBP1u + XBP1s）的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法不同，该检测法完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。人源总 XBP1 检测法使用两种标记抗体，一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 XBP1s 或 XBP1u 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET（荧光共振能量转移）信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，且该检测法采用无洗涤形式，为评估蛋白质的表达提供了途径。

总检测原理
总 XBP1 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入人源总 XBP1 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

总检测方案
总 XBP1 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测人源总 XBP1 可在单个用于培养、刺激和裂解的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

总 XBP1 检测方案

检测验证

总 XBP1 和 XBP1s 的药理学验证（激活剂）
将 Hep-G2 或 MCF7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用浓度递增的毒胡萝卜素（Thapsigargin）处理细胞 4 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂，然后用 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 XBP1 和 XBP1s 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，毒胡萝卜素化合物诱导了 XBP1s 形式的翻译，XBP1s 信号水平呈剂量依赖性增加。总 XBP1 信号在该处理下也略有增加。

总 XBP1 检测验证
总 XBP1 检测验证
总 XBP1 检测的药理学验证（抑制剂）
将 MCF7 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基培养，并在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用毒胡萝卜素（半数有效浓度 EC80：150nM）和浓度递增的两种抑制剂（APY29 和 MKC3946）共同处理细胞 4 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂，然后用 50µl 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

细胞裂解后，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，并加入 4µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。在室温下孵育 18 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期的那样，由毒胡萝卜素刺激诱导的轻微 HTRF 信号被 APY29 和 MKC3946 化合物抑制，其半数抑制浓度（IC50）分别为 1.1µM 和 1.7µM，这意味着总 XBP1 的表达量有所减少。

总 XBP1 检测验证
XBP1 检测的特异性
将 HAP1 细胞和 HAP1 XBP1 敲除细胞（来自 Horizon Discovery）在 T175 培养瓶中用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 3mL 补充的裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

在 HAP1 XBP1 敲除细胞中未检测到信号，而在 HAP1 野生型细胞中检测到信号，这证明了该检测法对 XBP1 蛋白的特异性。

总 XBP1 检测验证
不同细胞系中总 XBP1 的检测
将贴壁的人源和鼠源 HAP1、MCF7 和 Hep-G2 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种到 96 孔微孔板中。孵育 24 小时后，用毒胡萝卜素在 37°C 下处理细胞 4 小时。然后用补充的裂解缓冲液 #1 裂解细胞，将 16µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。过夜孵育后记录 HTRF 信号。

HTRF 总 XBP1 检测法能够有效检测不同细胞模型中表达水平各异的 XBP1 蛋白（XBP1s + XBP1u）。

总 XBP1 检测验证
HTRF 总 XBP1 检测法与蛋白质印迹法的比较
将 MCF7 细胞在 T175 培养瓶中用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下培养 24 小时。用 700nM 的毒胡萝卜素化合物处理细胞 4 小时，培养条件为 37°C、5% CO₂，然后用 3mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #1 在室温下轻轻振荡裂解 30 分钟。

使用补充的 1X 裂解缓冲液 #1 对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 每种稀释液转移到小体积白色微孔板中，然后加入 4µL HTRF 总 XBP1 检测试剂。

使用等量的裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些条件下，HTRF 总 XBP1 检测法的灵敏度是蛋白质印迹技术的 2 倍。

总 XBP1 检测验证

简化通路

XBP1 通路
XBP1 是调节细胞存活的未折叠蛋白反应（UPR）的关键组成部分。存在三种未折叠蛋白反应通路，涉及不同的介质，如 ATF6、IRE1 和 PERK，并会产生显著的下游效应。

当发生内质网应激且未折叠蛋白积累时，BiP 会释放其对三种内质网应激蛋白的抑制性结合，并激活它们。

IRE1 被激活后，首先发生二聚化，然后发生自身磷酸化，从而激活其 mRNA 酶活性。通过这一作用，IRE1 将 XBP-1u mRNA 剪接为 XBP1s mRNA，使其能够进行翻译并随后转运至细胞核。XBP-1s 随后发挥转录因子的作用。

pathway-total-XBP1-64xbptpeg-64xbptpeh-64xbptpey.svg（总 XBP1 通路图）

规格参数

其他规格

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、裂解缓冲液 4
分子修饰：总（蛋白）
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64XBPTPEH

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