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HTRF ZAP-70 P-Y319 KIT - 500 PTS 磷酸化ZAP-70检测试剂盒 - 500测试

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概述

磷酸化 ZAP-70（Tyr319）细胞检测试剂盒是监测 T 细胞活化的理想工具，T 细胞活化会导致 ZAP-70 在酪氨酸 319 位点发生磷酸化。ZAP-70 是一种在 T 细胞和自然杀伤（NK）细胞中表达的胞质蛋白酪氨酸激酶，在抗原受体启动 T 细胞应答的过程中发挥关键作用。

工作原理

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）检测原理

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）检测试剂盒用于检测在 Tyr139 位点发生磷酸化的 ZAP-70。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。
此检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 ZAP-70（Tyr139）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 ZAP-70（Tyr139）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ZAP-70（Tyr139）可在单个平板中完成，该平板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

基于人 Jurkat 细胞的磷酸化 ZAP-70（Tyr319）细胞检测：HTRF 检测与蛋白质印迹法的对比

Jurkat 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下在 T175cm² 培养瓶中培养 2 天。取 4.5 mL 细胞悬液（13×10⁶个细胞 /mL），用抗 CD3 抗体（终浓度 20 µg/mL）刺激 2.5 分钟。刺激后，加入 2.25 mL 4X 补充裂解缓冲液，在室温下裂解细胞 30 分钟。随后用相同的补充裂解缓冲液对纯裂解液进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液分别通过 HTRF 检测和蛋白质印迹法进行平行分析。

磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测的细胞密度优化

本检测采用双板方案：将 Jurkat 细胞以 200,000 个细胞 / 孔或 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，每孔 25 µL，使用含 10% FBS 的完全 RPMI 培养基。用终浓度为 20 µg/mL 的抗 CD3 抗体刺激细胞 2.5 分钟，然后加入 10 µL 4X 补充裂解缓冲液裂解细胞。取 16 µL 各细胞裂解液转移至检测板，使用 HTRF 磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测试剂盒进行分析。

细胞刺激动力学研究 —— 磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测

本检测采用双板方案：将 Jurkat 细胞以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，每孔 25 µL，使用含 10% FBS 的完全 RPMI 培养基。用终浓度为 20 µg/mL 的抗 CD3 抗体分别刺激细胞不同时间（分钟），刺激后加入 10 µL 4X 补充裂解缓冲液裂解细胞。取 16 µL 各细胞裂解液，使用 HTRF 磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测试剂盒进行分析。

免疫检查点抑制剂 PD-L1 活性监测

由于磷酸化 ZAP-70（Tyr319）可作为 T 细胞活化的读数指标，因此被用于监测 PD-L1 重组蛋白对 T 细胞活化的抑制作用。本检测采用双板方案：将 400,000 个 Jurkat 细胞接种到 96 孔培养板中，每孔 25 µL 含 10% FBS 的完全 RPMI 培养基。细胞与不同浓度的 PD-L1 重组蛋白预孵育 24 小时，然后用终浓度为 20 µg/mL 的抗 CD3 抗体刺激 2.5 分钟，直接加入 10 µL 4X 补充裂解缓冲液裂解细胞，在室温下孵育 30 分钟。取 16 µL 各样本，分别使用磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测试剂盒和总 ZAP-70 检测试剂盒进行分析。将磷酸化 ZAP-70 的检测结果以总 ZAP-70 的量进行归一化处理并绘制图表，结果显示，当 PD-L1 重组蛋白终浓度为 40 µg/mL 时，磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测记录到轻微但显著的抑制效应。

简化通路

ZAP-70 的功能与调控

T 细胞受体（TCR）激活后，淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）会催化 TCR/CD3 复合物胞质侧的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs）发生磷酸化。ZAP-70 被招募到 TCR/CD3 复合物上并发生磷酸化激活，进而促进下游衔接蛋白或支架蛋白的招募与磷酸化。

规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 3、裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：肿瘤学与炎症
单位规格：500 次检测

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货号：64ZAPPEG

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