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HTRF ZAP-70 TOTAL KIT - 10K PTS

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概述

Total ZAP-70 细胞检测试剂盒旨在监测 ZAP-70 蛋白（包括磷酸化和非磷酸化形式）的表达水平。该试剂盒与我们的磷酸化 ZAP-70 试剂盒兼容，能够从单个样本中同时分析磷酸化蛋白和总蛋白，从而更好地反映 T 细胞的活化情况。ZAP-70 是一种在 T 细胞和自然杀伤细胞中表达的胞质蛋白酪氨酸激酶，在抗原受体启动 T 细胞反应的过程中起着关键作用。

检测原理

Total-ZAP-70 检测原理
Total-ZAP-70 检测可对细胞裂解物中 ZAP-70 的表达水平进行定量分析。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。Total-ZAP-70 检测使用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。这两种抗体都对该蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ZAP-70 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样本中蛋白质的浓度直接成正比，并且可在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的表达。

Total-ZAP-70 双板检测方案
双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入 Total-ZAP-70 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Total-ZAP-70 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 ZAP70 可在单个培养、刺激和裂解用板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

使用人 Jurkat 细胞的 ZAP-70 细胞检测，对 HTRF 检测与蛋白质印迹法进行比较
Jurkat 细胞在添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中，于 37°C、5% CO₂ 环境下，在 T175cm² 培养瓶中培养 2 天。取 4.5 ml 细胞悬液（13×10⁶ 个细胞 /ml），用抗 CD3 抗体（终浓度 20 µg /ml）刺激 2.5 分钟。刺激后，在室温下加入 2.25 ml 4 倍浓度的补充裂解缓冲液，裂解细胞 30 分钟。然后将纯裂解物在相同的补充裂解缓冲液中进行系列稀释。取 16 µL 每种稀释液，分别通过 HTRF 和蛋白质印迹法进行平行分析。

细胞刺激动力学 - Total ZAP-70 检测
本检测采用双板检测方案进行。将 Jurkat 细胞以 400,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，每孔加入 25 µL 含 10% FBS 的完全 RPMI 培养基。使用终浓度为 20 µg /ml 的抗 CD3 抗体对细胞进行不同时间（分钟）的刺激。刺激后，加入 10 µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞。取 16 µL 每种细胞裂解物，用 HTRF 总 ZAP-70 检测试剂盒进行分析。

免疫检查点抑制剂 PD-L1 活性监测
由于磷酸化 ZAP-70（Tyr319）是 T 细胞活化的一个读数，因此可用于监测 PD-L1 重组蛋白对 T 细胞活化的抑制作用。本检测采用双板检测方案进行。将 400,000 个 Jurkat 细胞接种到 96 孔培养板中，每孔加入 25 µL 含 10% FBS 的完全 RPMI 培养基。将细胞与不同浓度的 PD-L1 重组蛋白预孵育 24 小时。然后用 20 µg /ml 的抗 CD3 抗体（终浓度）刺激细胞 2.5 分钟，直接加入 10 µL 4 倍浓度的补充裂解缓冲液裂解细胞，随后在室温下孵育 30 分钟。取 16 µL 每个样本，用磷酸化 ZAP-70（Tyr319）和总 ZAP-70 检测试剂盒进行分析。将磷酸化 ZAP-70 的结果与总 ZAP-70 的量进行归一化处理，并绘制在图表上。在终浓度为 40 µg /ml 时，磷酸化 ZAP-70（Tyr319）检测记录到 PD-L1 重组蛋白有轻微但显著的抑制作用。

简化通路

ZAP-70 的功能与调节
T 细胞受体（TCR）的结合会促进淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶（Lck）对 TCR/CD3 复合物胞质侧的免疫受体酪氨酸活化基序（ITAMs）进行磷酸化。Zap-70 被招募到 TCR/CD3 复合物上，并在此处发生磷酸化而活化，进而促进下游衔接蛋白或支架蛋白的招募和磷酸化。

规格

其他规格
应用
细胞信号传导
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
裂解缓冲液兼容性
裂解缓冲液 3
裂解缓冲液 4
裂解缓冲液 5
分子修饰
总蛋白
产品类别
试剂盒
样本体积
16 µL
运输条件
干冰运输
靶标类别
磷酸蛋白
靶标物种
人
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
肿瘤学与炎症
单位规格
10,000 个检测点

没有数据

货号：64ZATPEH

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