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HTRF LRRK2 P-S935 KIT - 500 PTS 磷酸化富含亮氨酸重复激酶2检测试剂盒-500测试

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品牌： Revvity

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概述

磷酸化 LRRK2（Ser935）试剂盒可直接在您感兴趣的细胞类型中检测内源性在 Ser935 位点磷酸化的 LRRK2 蛋白。LRRK2 是神经科学研究中的重要靶点，涉及帕金森病（PD）及一般神经退行性疾病。

工作原理

磷酸化 LRRK2（Ser935）检测原理

磷酸化 LRRK2（Ser935）检测用于测量在 Ser935 位点磷酸化的 LRRK2。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。
此检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 LRRK2（Ser935）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 LRRK2（Ser935）HTRF 检测试剂。该方案可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 LRRK2（Ser935）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 LRRK2（Ser935）可在单个平板中完成，该平板可用于细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案支持微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

检测验证

HTRF 磷酸化 LRRK2 检测与蛋白质印迹法的对比

鼠源 NIH-3T3 细胞培养 2 天至 100% 汇合度。细胞裂解后，离心 10 分钟收集可溶性组分。用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液，分别通过蛋白质印迹法（WB）和 HTRF 法进行平行分析。结果显示，HTRF 磷酸化检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍：使用 HTRF 磷酸化 LRRK2 检测时，仅需 2,500 个细胞即可检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要 20,000 个细胞才能产生信号。

NIH 3T3 细胞中磷酸化 LRRK2 的检测

细胞在 6 孔板中培养，并用不同浓度的 CZC和 GSK处理 2 小时。移除培养基，更换为 Revvity 裂解缓冲液，作用 1 小时。从每孔取 16 µL 裂解液转移至 384 孔板，用 HTRF 试剂进行检测。Revvity 磷酸化 LRRK2 检测能够清晰测定两种抑制剂的 IC50，与文献结果一致。

使用肽段验证磷酸化 LRRK2 检测对 Ser935 磷酸化的特异性

在 T175 培养瓶中，用编码人突变型 LRRK2 G2019S 蛋白的质粒转染 HEK293 细胞 24 小时，然后用 100 nM 花萼海绵诱癌素 - A 处理 30 分钟。加入 3 mL 补充裂解缓冲液 #4，在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。
竞争检测在 384 孔低体积白色微孔板中进行：加入 14 µL 细胞裂解液（预先用补充裂解缓冲液稀释 100 倍）、2 µL 各肽段（用补充裂解缓冲液系列稀释）和 4 µL HTRF 磷酸化 LRRK2（Ser935）检测试剂。在室温下孵育 4 小时后，用 EnVision Nexus 读数仪记录 HTRF 信号。
LRRK2 磷酸化 Ser935 肽段对 HTRF 信号产生剂量依赖性抑制，而其他肽段存在时信号无变化。这些结果表明，HTRF 检测可特异性检测 LRRK2 上磷酸化的 Ser935 残基。

规格参数

其他规格
应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液 4、裂解缓冲液 5
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：神经科学
单位规格：500 次检测

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货号：6FLRKPEG

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