HTRF IRF3 P-S386 KIT - 10K PTS 磷酸化IRF3检测试剂盒 - 10,000测试

概述

磷酸化IRF3细胞检测试剂盒可便捷、准确地定量在Ser386位点磷酸化的IRF3。在病毒感染的细胞中，转录因子IRF3的磷酸化会诱导抗病毒和促炎细胞因子的产生，这是先天免疫系统的关键要素。该磷酸化IRF3检测试剂盒可用于从基础研究到临床前药物研发的各个阶段，且包含实验所需的全部材料。与ELISA/蛋白质印迹法（WB）相比，其检测通量更高。工作原理

磷酸化IRF3（Ser386）检测原理 磷酸化IRF3（Ser386）检测用于测量在Ser386位点发生磷酸化的IRF3。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化IRF3（Ser386）检测使用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生FRET信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且无需洗涤步骤即可评估蛋白质的磷酸化状态。 磷酸化IRF3（Ser386）双板检测方案 双板方案包括：先在96孔板中培养细胞，裂解后将裂解液转移至384孔低体积检测板，再加入磷酸化IRF3（Ser386）HTRF检测试剂。该方案能够监测细胞活力和汇合度。 磷酸化IRF3（Ser386）单板检测方案 使用HTRF试剂检测磷酸化IRF3（Ser386）可在单个用于培养、刺激和裂解的平板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的HTRF检测质量。检测验证

花萼海绵诱癌素（Calyculin）孵育时间优化 花萼海绵诱癌素是一种强效的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂，用于诱导MCF7细胞中IRF3的磷酸化。用400 nM花萼海绵诱癌素处理MCF7细胞不同时间（45分钟、1小时、2小时或3小时）后，加入50 µL补充裂解缓冲液裂解细胞，并在室温下轻轻振荡孵育30分钟。取16 µL裂解液转移至384孔低体积白色微孔板中，再加入4 µL HTRF磷酸化IRF3检测试剂。孵育过夜后记录HTRF信号。 2-3环磷酸鸟苷-腺苷（cGAMP）刺激后的IRF3磷酸化 在96孔板中每孔接种125,000个MCF7细胞，使用完全培养基培养，在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。加入50 µg/mL的2-3 cGAMP，在37°C下分别孵育不同时间。移除细胞培养基后，加入50 µL裂解缓冲液，在室温下裂解30分钟。取16 µL裂解液转移至384孔白色小体积板中，再加入4 µL HTRF磷酸化IRF3检测试剂。孵育过夜后记录HTRF信号。

人MCF7细胞中磷酸化IRF3检测与蛋白质印迹法的对比 人MCF7细胞培养48小时后，用200 nM花萼海绵诱癌素刺激2小时，然后裂解细胞。通过离心收集可溶性组分，用补充裂解缓冲液对细胞裂解液进行系列稀释，取16 µL各稀释液，分别通过蛋白质印迹法和HTRF法进行平行分析。使用HTRF磷酸化IRF3（Ser386）检测时，仅需2,500个细胞即可检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要10,000个细胞才能产生信号。HTRF磷酸化IRF3检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的4倍。简化通路

IRF3简化通路 IRF3是I型干扰素（IFN-α和IFN-β）依赖性免疫反应的关键转录调节因子，在针对DNA和RNA病毒的先天免疫反应中发挥重要作用。在未感染细胞的细胞质中，IRF3以非活性形式存在；在病毒感染、双链RNA（dsRNA）、 toll样受体（TLR）和STING信号通路的作用下，IRF3会被TBK1在Ser386位点磷酸化，进而发生构象变化，形成二聚体并进入细胞核，激活I型干扰素基因的表达。规格

其他规格 应用：细胞信号传导 品牌：HTRF 检测方式：HTRF 裂解缓冲液兼容性：裂解缓冲液2、裂解缓冲液3 分子修饰：磷酸化 产品类别：试剂盒 样本体积：16 µL 运输条件：干冰运输 靶标类别：磷酸化蛋白 靶标物种：人 技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET） 治疗领域：心血管疾病、传染病、非酒精性脂肪性肝炎/肝纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症 单位规格：10,000个检测点