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HTRF IRF3 P-S386 KIT - 50K PTS

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概述

基于磷酸化 IRF3 细胞的检测试剂盒可便捷、准确地定量 Ser386 位点磷酸化的 IRF3。在病毒感染的细胞中，转录因子 IRF3 的磷酸化会诱导抗病毒和促炎细胞因子的产生，这是先天免疫系统的关键要素。该磷酸化 IRF3 检测可用于从基础研究到临床前药物发现的各个阶段，且包含所需的全部物品。与 ELISA/WB 相比，它具有更高的通量。

工作原理

磷酸化 IRF3（Ser386）检测原理

磷酸化 IRF3（Ser386）检测用于测量在 Ser386 位点发生磷酸化的 IRF3。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 IRF3（Ser386）检测使用两种标记抗体：一种带有供体荧光团，另一种带有受体荧光团。第一种抗体经选择可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能不依赖蛋白质的磷酸化状态识别该蛋白质。蛋白质磷酸化会促成包含两种标记抗体的免疫复合物形成，使供体荧光团与受体荧光团接近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且在无需洗涤的检测格式下即可评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 IRF3（Ser386）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，接着将裂解物转移到 384 孔小体积检测板中，之后再加入磷酸化 IRF3（Ser386）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

磷酸化 IRF3（Ser386）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 IRF3（Ser386）可在单个用于培养、刺激和裂解细胞的板中进行。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化，同时保持稳定的 HTRF 质量。

检测验证

花萼海绵诱癌素（Calyculin）孵育时间的优化

花萼海绵诱癌素是一种强效的丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂，用于诱导 MCF7 细胞中 IRF3 的磷酸化。用 400 nM 花萼海绵诱癌素处理不同时间（45 分钟、1 小时、2 小时或 3 小时）后，用 50 µL 补充的裂解缓冲液裂解 MCF7 细胞，并在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。将 16 µL 裂解物转移到 384 孔小体积白色微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 磷酸化 IRF3 检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

2-3 环磷酸鸟苷 - 腺苷（cGAMP）刺激后的 IRF3 磷酸化

在 96 孔板中，每孔接种 125,000 个 MCF7 细胞于完全培养基中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。加入 50 µg/mL 的 2-3 cGAMP，然后在 37°C 下孵育不同时间。去除细胞培养液后，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下裂解细胞 30 分钟，随后将 16 µL 裂解物转移到 384 孔白色板中，并加入 4 µL HTRF 磷酸化 IRF3 检测试剂。孵育过夜后获取 HTRF 信号。

人 MCF7 细胞中磷酸化 IRF3 检测与蛋白质印迹法的比较

培养人 MCF7 细胞 48 小时，然后用 200 nM 花萼海绵诱癌素刺激 2 小时后裂解细胞。通过离心收集可溶性组分，用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16 µL 各稀释液分别点样，同时采用蛋白质印迹法和 HTRF 法进行分析。使用 HTRF 磷酸化 IRF3（Ser386）检测时，仅需 2,500 个细胞即可检测到最小信号，而蛋白质印迹法则需要 10,000 个细胞才能产生信号。HTRF 磷酸化 IRF3 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍。

简化通路

IRF3 简化通路

IRF3 是 I 型干扰素（IFN-α 和 IFN-β）依赖性免疫反应的关键转录调节因子。它在针对 DNA 和 RNA 病毒的先天免疫反应中发挥着关键作用。在未感染细胞的细胞质中，IRF3 以非活性形式存在；在病毒感染、双链 RNA（dsRNA）、 Toll 样受体（TLR）和 STING 信号通路的作用下，IRF3 会被 TBK1 在 Ser386 位点磷酸化。这会引起构象变化，导致其 dimerization（二聚化）并定位于细胞核，从而激活 I 型 IFN 基因的表达。

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白质
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、传染病、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤学与炎症
单位规格：50,000 个检测点

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货号：6FRF3PEY

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