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HTRF (H) FLT3 P-Y842 KIT - 10K PTS

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品牌： Revvity

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概述

HTRF 磷酸化酪氨酸 842 人 FLT3（Fms 样酪氨酸激酶 3，又称 FLK2）检测法可监测多种细胞中野生型 FLT3（FLT3 WT）和 / 或内部串联重复（ITD）FLT3 突变体在酪氨酸 842 位点的磷酸化情况。FLT3 是 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化，并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，进而促进免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致免疫细胞无序增殖、未成熟化及致癌表型。FLT3 是急性髓系白血病（AML）中最常见的突变基因，其突变会导致受体激酶活性持续激活或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体在 AML 中的作用已得到明确，因此 FLT3 突变体成为制药行业的重要药物靶点。

工作原理

磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测原理

磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测用于测定在酪氨酸 842 位点发生磷酸化的 FLT3。与蛋白质印迹法不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。

磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测使用两种抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能独立于蛋白质的磷酸化状态对其进行识别。蛋白质的磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号的强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，且能在无需洗涤的检测形式下评估蛋白质的磷酸化状态。

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磷酸化 FLT3（Tyr 842）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔小体积检测板，再加入磷酸化 FLT3 Tyr842 HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

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磷酸化 FLT3（Tyr 842）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 FLT3 Tyr842 可在单个用于培养、刺激和裂解的培养板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案能够实现微型化操作，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

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检测验证

FLT3-L 处理对磷酸化 FLT3（Tyr 842）的药理学调节

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞和 THP1 细胞分别以 250,000 个 / 孔和 500,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用浓度递增的 FLT3 配体（FLT3-L）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟，然后用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 589/591、磷酸化 FLT3 Tyr 842 或总 FLT3 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号（注：对于磷酸化 Tyr 842 检测，可通过过夜孵育增强信号）。

正如预期，FLT3-L 诱导 FLT3 发生二聚化，同时酪氨酸 589、591 和 842 位点的磷酸化水平呈剂量依赖性增加，而 FLT3 总蛋白的表达水平未受影响。

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使用 HTRF 磷酸化 FLT3（Tyr 842）和总 FLT3 检测抑制剂对 BaF3 ITD 和 MV4-11 细胞的作用

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞以 250,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。用 115 ng/mL 的 FLT3-L（EC80）和浓度递增的奎扎替尼（Quizartinib）、米哚妥林（Midaustaurin）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 2 小时。然后移除培养基，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 和总 FLT3 检测试剂。在室温下过夜孵育后记录 HTRF 信号。

奎扎替尼和米哚妥林的半数抑制浓度（IC50）分别测得为 0.5 ng/mL 和 11 ng/mL。

这两种化合物均未影响 FLT3 总蛋白的表达水平。

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磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测的特异性

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞以 250,000 个 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。在存在或不存在 1µM 包含酪氨酸 842 磷酸化位点的磷酸化肽段的情况下，用高浓度 FLT3 配体（FLT3-L）在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。随后，用 50 µL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔小体积白色微孔板中，加入 4 µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

正如预期，磷酸化肽段与 FLT3 受体的磷酸化位点竞争结合，导致信号完全消失。这证明了该检测的特异性。

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HTRF 磷酸化 FLT3（Tyr 842）检测与蛋白质印迹法的比较

将稳定表达 FLT3 的 Ba/F3 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。用 0.5 µg/mL 的 FLT3 配体在 37°C、5% CO₂条件下处理细胞 15 分钟。移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液 #4 在室温下轻轻摇晃 30 分钟裂解细胞。

用补充的 1X 裂解缓冲液 #4 对细胞裂解物进行系列稀释，然后将 16µL 纯样品和各稀释液转移至 384 孔小体积微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 检测试剂。过夜孵育后记录信号。

取等量的裂解物上样到凝胶中，用于 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

在这些实验条件下，HTRF 磷酸化 FLT3 Tyr 842 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 16 倍。

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简化通路

FLT3 受体信号通路

FLT3 是 III 类受体酪氨酸激酶，在免疫细胞中表达，通过其配体 FLT3L 激活。与 FLT3L 结合后，FLT3 受体发生二聚化，并激活多种通路，包括磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）和 MAPK 通路，进而调控免疫细胞的分裂、增殖和存活。FLT3 通路的失调可能导致细胞无序增殖、免疫细胞未成熟及致癌表型。FLT3 基因的突变会导致受体激酶活性持续激活或破坏受体的自身抑制活性。ITD FLT3 突变体无需 FLT3L 即可激活其下游通路。FLT3 在白血病（尤其是急性髓系白血病，AML）的发生发展中具有重要作用。

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规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷蛋白
靶标物种：人
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64FLT3Y2PEH

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