当前位置：首页 > 产品中心 > Revvity 均相检测试剂 > Phosphoproteins > HTRF (H) KRAS TOTAL KIT - 50K PTS

HTRF (H) KRAS TOTAL KIT - 50K PTS

分享给好友

rvty_ls_sds_64KRASTPEG_US rvty_ls_sds_64KRASTPEG_UK rvty_ls_sds_64KRASTPEG_SPA rvty_ls_sds_64KRASTPEG_ITA rvty_ls_sds_64KRASTPEG_ELL rvty_ls_sds_64KRASTPEG_DEU rvty_ls_sds_64KRASTPEG_FRA

收藏咨询

品牌： Revvity

产品详情
相关解决方案
相关资源
相关视频
相关问答

概述

KRAS 是一种单体 GTP 酶，可传递来自受体酪氨酸激酶的信号，进而调控细胞增殖、分化或存活。作为癌症中最常发生突变的致癌基因之一，KRAS 突变常与不良预后和治疗耐药性相关。其中，KRAS G12C 突变是较常见的类型，该突变会使 KRAS 处于持续的 GTP 结合状态，呈现组成型活性，过度激活下游 MAPK 等效应信号通路，最终驱动肿瘤生长。

工作原理

总 KRAS 检测原理

总 KRAS 检测用于定量细胞裂解物中 KRAS 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测为全板基检测，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对 KRAS 蛋白上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 KRAS 时，这两种抗体与蛋白结合形成复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。信号强度与样品中 KRAS 的浓度直接成正比，且可在无需洗涤的检测形式下实现蛋白质表达水平的评估。

HTRF 总 DDR1 检测原理

总 KRAS 双板检测方案

双板方案流程为：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入 HTRF 总 KRAS 检测试剂。该方案可监测细胞的活力和汇合度。

HTRF 磷酸化 Y1604 ALK 检测双板方案
总 KRAS 单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测总 KRAS 时，可在单个培养板中完成细胞培养、刺激、裂解及检测全过程，无需洗涤步骤。这种专为高通量筛选（HTS）设计的方案支持实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

HTRF 磷酸化 Y1604 ALK 检测单板方案

检测验证

利用 PROTAC® 在多种细胞系中选择性降解 KRAS G12C

将 Mia-Paca-2、SW1573 和 Calu-1 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养板中，用完全培养基在 37°C、5% CO₂条件下过夜孵育。次日，用浓度递增的 LC-2 PROTAC（用于诱导 KRAS G12C 突变体降解）和 MRTX-849（KRAS G12C 共价抑制剂，同时也是 LC-2 PROTAC 的弹头部分）处理细胞 24 小时。对照组细胞在添加 PROTAC 前，先用 1 µM 蛋白酶体抑制剂埃博霉素在 37°C 下预孵育 1 小时。

处理后，用 50 µL 补充的 6 号裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。随后，将 16 µL 经补充的 6 号裂解缓冲液稀释一半的裂解物转移至 ProxiPlate-384 微孔板（#6008280/9）中，加入 4 µL HTRF 总 KRAS 检测抗体，室温过夜孵育后记录 HTRF 信号。

同时，取 4 µL 裂解物（补充 12 µL 8 号稀释剂）转移至微孔板，使用 HTRF α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPEG/H）检测内参蛋白 α- 微管蛋白，过夜孵育后记录 HTRF 信号。

结果显示，LC-2 PROTAC 在三种细胞系中均引发 KRAS 蛋白水平呈剂量依赖性降低，而特异性 KRAS G12C 抑制剂 MRTX-849 无此作用。在埃博霉素存在时未观察到 KRAS 水平下降，证实降解过程由泛素 - 蛋白酶体系统驱动。相同实验条件下，α- 微管蛋白水平保持不变（数据未显示）。

检测验证
检测验证
检测验证

利用 HAP-1 KRAS 敲除细胞系验证 HTRF 总 KRAS 检测的特异性

根据 Revvity 旗下 Horizon Discovery 团队的数据，对 HAP-1 细胞中 KRAS、HRAS 和 NRAS 基因的 RNA 表达水平进行定量分析，结果显示这三种基因在 HAP-1 细胞中均有显著表达（产品目录参考：Revvity Horizon Discovery 产品 HAP1 WT #C631）。

制备 HAP1 野生型细胞和 HAP1-KRAS 敲除细胞（产品目录参考：Revvity Horizon Discovery 产品 HAP1 KO KRAS #HZGHC005816c001）的裂解物，用 HTRF 总 KRAS 试剂盒检测以验证 KRAS 检测的特异性，确保检测 KRAS 时不与 NRAS 和 HRAS 发生交叉反应。

结果显示，在表达 NRAS 和 HRAS 的 HAP-1 KRAS 敲除细胞中未检测到 HTRF 信号，证实该试剂盒仅特异性检测 KRAS。

检测验证
检测验证

多种细胞系中总 KRAS 表达水平的定量

制备不同 12 号密码子基因型的商用细胞系裂解物，用 HTRF 总 KRAS 试剂盒检测。所有受测细胞系均检测到显著的 KRAS 表达（见表）。

在三种 KRAS G12C 纯合细胞模型和一种 WT/G12C 杂合细胞模型中，用 HTRF 总 KRAS 试剂盒监测 KRAS 水平，同时用 HTRF α- 微管蛋白内参细胞检测试剂盒（64ATUBPEG/H）检测 α- 微管蛋白作为参考基因。

商用细胞系包括：HT-29（纯合野生型）、RKO（纯合野生型）、HCT-116（纯合野生型）、SW1463（纯合 G12C）、SW1573（纯合 G12C）、Mia-PaCa-2（纯合 G12C）、Calu-1（纯合 G12C）、AsPC-1（纯合 G12D）、SW480（纯合 G12V）、NCI-H358（杂合 G12C / 野生型），均通过 HTRF 总 KRAS 试剂盒检测到 KRAS 表达。

检测验证
检测验证

HTRF 总 KRAS 检测与蛋白质印迹法的比较

SW480 细胞在 T175 培养瓶的完全培养基中于 37°C、5% CO₂条件下培养至 80% 汇合度。移除培养基后，用 3 mL 补充的 1X 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。

检测验证
用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，取 16 µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板，加入 4 µL HTRF 总 KRAS 检测试剂。取等量裂解物进行 HTRF 与蛋白质印迹法的平行比较。

结果显示，HTRF 总 KRAS 检测在 4000 个细胞 / 孔即可检测到显著信号，而蛋白质印迹法需 31000 个细胞 / 孔才能获得最小化学发光信号。因此，在此条件下，HTRF 总 KRAS 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 7.5 倍。

简化通路

KRAS 信号通路

KRAS 是一种小型 GTP 酶，作为分子开关在活性 GTP 结合状态与非活性 GDP 结合状态之间循环。受上游信号（如生长因子与受体酪氨酸激酶（RTKs）结合）激活后，KRAS 会激活多个下游效应通路，其中最主要的是 RAF-MEK-ERK 通路和 PI3K-AKT 通路。RAF-MEK-ERK 通路促进细胞增殖和分化，PI3K-AKT 通路则支持细胞存活和代谢。KRAS 的突变（尤其是 12、13 和 61 号密码子突变）会使其锁定在活性状态，导致细胞失控分裂并引发癌症。这种失调在胰腺癌、结直肠癌和肺癌等多种癌症中较为常见。

简化通路

规格参数

应用领域：细胞信号传导
品牌：HTRF
缓冲液 / 溶剂：6 号裂解缓冲液
检测方式：HTRF
宿主物种：人
兼容裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰类型：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16 µL
运输条件：干冰运输
靶标：KRAS
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人
技术原理：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：炎症、肿瘤
单位规格：500 次检测

没有数据

货号：64KRASTPEY

一键复制

参考价格 ¥ 556131.51

产品规格

请咨询￥556131.51

参考货期：3-4周

选择数量

当前规格1件起购

加入购物车询价