HTRF RB P-S807/811 KIT - 10K PTS 磷酸化RB(S807/811)试剂盒–10,000测试

概述
这种基于时间分辨荧光共振能量转移（HTRF）的细胞检测方法能够便捷且准确地定量视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白在丝氨酸 807/811（Ser807/811）位点的磷酸化水平。Rb 蛋白属于口袋蛋白家族，具有肿瘤抑制作用，可调节细胞周期进程。活性的低磷酸化 Rb 蛋白形式会与 E2F 转录因子相互作用并抑制其转录活性，从而阻止细胞从 G0/G1 期过渡并继续细胞周期进程。在有丝分裂信号存在的情况下，细胞周期蛋白 D - 细胞周期蛋白依赖性激酶 4/6（cyclin D-CDK4/6），随后是细胞周期蛋白 E - 细胞周期蛋白依赖性激酶 2（cyclin E-CDK2），会依次对 Rb 蛋白进行磷酸化并使其失活，进而释放出细胞周期进程所需的 E2F 转录因子。

规格
其他规格

作用原理
磷酸化 Rb（Ser807/811）检测原理
磷酸化 Rb（Ser807/811）检测用于测量 Rb 蛋白在 Ser807/811 位点的磷酸化情况。与蛋白质免疫印迹（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 Rb（Ser807/811）检测使用两种标记抗体，一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态的影响。蛋白质磷酸化促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团紧密靠近，从而产生荧光共振能量转移（FRET）信号。该信号强度与样品中存在的磷酸化蛋白浓度直接成正比，并且在无需洗涤的检测形式下提供了一种评估蛋白质磷酸化状态的方法。

[磷酸化 Rb（Ser807/811）检测试剂盒原理图示]

磷酸化 Rb（Ser807/811）双板检测方案
双板检测方案包括先在 96 孔板中培养细胞，然后进行裂解，在加入 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）检测试剂之前，将细胞裂解物转移至低体积检测板（HTRF 384 孔低体积板或 96 孔低体积板）中。该方案能够对细胞活力和汇合度进行监测。

磷酸化 Rb（Ser807/811）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 Rb（Ser807/811）可在单个用于培养、刺激和裂解细胞的板中进行，无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案在实现小型化的同时，保持了 HTRF 检测的高质量。

[磷酸化 Rb（Ser807/Ser811）单板检测方案图示]

检测验证
在人结肠癌细胞系 HCT-116 中，CDK4/CDK6 抑制剂帕博西尼（Palbociclib）能有效抑制视网膜母细胞瘤蛋白在 Ser807/811 位点的磷酸化
将 HCT-116 细胞以 50 微升的体积接种于 96 孔板（每孔 50,000 个细胞）的完全培养基中，并在 37°C、5% 二氧化碳的条件下孵育。6 小时后，用浓度逐渐增加的帕博西尼（额外添加 50 微升体积）处理细胞 19 小时。

弃去培养基后，用 50 微升补充的裂解缓冲液在室温下轻柔振荡裂解细胞 30 分钟，然后将 16 微升的细胞裂解物转移至低体积白色微孔板中，再加入 4 微升预混的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）或总 Rb 检测试剂。孵育 4 小时后记录 HTRF 信号。

用细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk4 和 Cdk 6）抑制剂帕博西尼处理细胞后，Rb 蛋白在丝氨酸 807/811 位点的磷酸化水平显著降低，同时该蛋白的总量也有所减少（正如 Liu 等人在 2017 年发表于《公共科学图书馆》（Plos）上的研究所述）。

磷酸化 Rb 细胞检测在人和小鼠细胞系上的验证
将 NIH 3T3、C2C12 和 HTC116 细胞以每孔 100,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳的条件下孵育过夜后，弃去细胞培养基，向细胞中加入 50 微升裂解缓冲液。进行裂解步骤，轻柔振荡 30 分钟。将 16 微升样品转移至 384 孔小体积板中，然后加入 4 微升三种 HTRF Rb 检测试剂中的每一种。4 小时后记录信号。

两种 HTRF 磷酸化检测方法均适用于小鼠模型。

[检测验证：Rb 蛋白磷酸化（S807/801）实验 2 图示]

使用磷酸化 Rb（Ser807/811）细胞检测方法对人 HCT116 细胞进行 HTRF 检测与 Western Blot 的比较
将人 HCT116 细胞在 T175 培养瓶中于 5% 二氧化碳、37°C 的条件下培养。当细胞汇合度达到 80% 时，裂解细胞并通过离心收集可溶性上清液。对细胞裂解物进行系列稀释，将每个稀释度的 16 微升转移至 384 孔低体积白色微孔板中，最后加入磷酸化 Ser807/811 Rb 细胞检测试剂盒试剂。并行比较显示，HTRF 磷酸化检测方法至少比 Western Blot 灵敏 27 倍。

[检测验证：Rb 蛋白磷酸化（S807/801）实验 3 图示]

简化通路
细胞分裂周期中的视网膜母细胞瘤蛋白
分子量为 110kDa 的视网膜母细胞瘤蛋白 Rb 属于口袋蛋白家族，该家族还包括 p107 和 p130 蛋白。

Rb 蛋白具有肿瘤抑制作用，可调节细胞周期进程。

使该蛋白失活的突变会导致视网膜母细胞瘤的发生，在这种情况下，视网膜细胞无法更新，并且会受到高水平的致突变性紫外线辐射。

在没有有丝分裂信号时，活性的低磷酸化 Rb 蛋白会结合并抑制进入 S 期所需的 E2F 转录因子。

通过使 E2F 转录因子失活，Rb 蛋白使细胞维持在 G1 期，阻止细胞周期的进程。

在有丝分裂信号存在时，Rb 蛋白会依次被 cyclin D-CDK4/6 和 cyclin E-CDK2 磷酸化并失活。这一磷酸化事件会促使 E2F 转录因子的释放。

最后，E2F 转录因子会激活诸如细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、胸苷激酶或增殖细胞核抗原（PCNA）等基因的转录，这些基因在 DNA 合成和复制以及细胞分裂中起着至关重要的作用。

[Rb 蛋白磷酸化（S807/811）通路图示]