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HTRF GTP GI BIND. KIT - 20K PTS

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概述

GTP Gi 结合检测可在膜提取物中 GPCR 受刺激时，检测受体上游的 Gi 蛋白活性。这种基于 HTRF 的非同位素检测方法操作简单、快速，且无需洗涤。

该检测使用 GTPγS，适用于 GPCR 模型研究以及化合物的药理学识别与表征。

工作原理

GTP Gi 结合检测原理

GTP Gi 结合检测使用穴状化合物标记的 GTP 类似物（供体）和 d2 标记的抗 Gi 抗体（受体）。GTP 类似物特异性结合到活性 G 蛋白的 GTP 结合口袋，而 d2 标记的抗体则特异性识别 G 蛋白的 Gαi 亚基。当存在两种检测试剂时，GPCR 的激活会使供体和受体靠近，从而触发 FRET 信号，其强度与样品中活性 Gi 蛋白的浓度成正比。GTPγS 是一种不可水解的 GTP 类似物，可用于将供体从 GTP 结合口袋中置换出来并终止 FRET，以确定检测的非特异性信号并确保其准确性。

GTP Gi 结合板检测方案

GTP Gi 结合检测以微型化形式进行，最终体积为 20 µl，采用简化的 4 步试剂添加方案，依次加入刺激物 / 化合物、激动剂、检测试剂和膜。根据生物模型的不同，在室温下孵育 3 小时或过夜后读取平板读数。无需洗涤步骤。

该方案使用先前为目标生物模型确定的优化条件（最佳膜量 / 孔，以及含有最佳浓度 MgCl₂和 GDP 的补充刺激缓冲液 #3）。优化程序和建议在相关指南中给出。

检测验证

CHO-δ 阿片受体膜提取物中的药理学反应

使用该膜模型先前优化的条件进行检测：刺激缓冲液 #3 补充有 0.5 µM GDP 和 50 mM MgCl₂。检测使用 5 µg 膜 / 孔。SNC-162 剂量反应曲线拟合显示 EC50 为 6.5 nM，与已发表的值一致。

GTP 结合检测的优化步骤要求

以 CHO-DOR 膜模型为例，研究刺激缓冲液中 MgCl₂和 GDP 浓度优化与否的情况。将 5 µg 膜在存在或不存在 SNC-162 激动剂（1 µM）的条件下孵育。平板在室温下孵育过夜后读取。

未经优化时，检测存在严重偏差，GPCR 基础活性和激动剂诱导活性之间的信号无差异。优化步骤显著降低了基础活性信号，从而突出了激动剂诱导的信号，信噪比（S/B）达到 2.8。优化建议和程序在试剂盒相关指南的优化部分有详细描述。

GTP 结合检测的膜量优化步骤

最佳膜量 / 孔可能因膜模型而异。额外的优化步骤包含三种条件（2.5、5 和 10 µg / 孔），可确定最佳膜量。以下是两个案例研究：

CHO-DOR 膜模型（Gi 偶联受体）：检测在 50 mM MgCl₂、0.5 µM GDP 存在下进行，用 10 µM SNC-162 激动剂刺激。
HEK293-NTS1 膜模型（主要为 Gq 偶联受体，次要为 Gi 偶联）：检测在 50 mM MgCl₂、不添加 GDP 的条件下进行，用 10 µM 神经降压素激动剂刺激。

图表显示了在不存在（基础）或存在激动剂（刺激）时获得的信号。每种条件下均给出信噪比。如图所示，膜量 / 孔是药理学信噪比优化的关键参数。对于这两种模型，5 µg 膜 / 孔是合适的。该优化步骤可能是提高检测信噪比或选择使用更低膜量（DOR 为 2.5 µg / 孔）的检测条件的决定性因素。

简化通路

GTP 在 GPCR 信号通路中的作用

异源三聚体 G 蛋白在非活性状态下，其 Ga 亚基的结合口袋中结合着 GDP。当激动剂刺激 GPCR 时，与受体偶联的 G 蛋白发生构象变化，使 Ga 亚基释放结合的 GDP 并替换为 GTP。这种核苷酸交换使 Ga 亚基完全激活，从 Gb/Gg 二聚体中解离，并根据其亚型（Gai、Gas、Gaq 等）对腺苷酸环化酶（AC）和磷脂酶 C（PLC）执行抑制或刺激功能。

接下来的信号转导步骤具有 GPCR 特异性，并调动不同的磷酸蛋白和通路。随着时间的推移，Ga 结合的 GTP 发生水解，使 Ga 蛋白回到非活性状态。

规格参数

其他规格参数

应用：第二信使检测
自动化兼容性：是
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
产品类别：试剂盒
样品体积：10 µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：G 蛋白偶联受体（GPCR）
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：心血管疾病、传染病、炎症、代谢 / 糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化、神经科学、肿瘤与炎症、罕见病
单位规格：20,000 个检测点

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货号：62GTPPEC

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