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HTRF GTP GI BIND. KIT - 500 PTS GTP Gi结合测试试剂盒 –500测试

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概述

GTP Gi 结合测定可在膜提取物中 GPCR 受刺激时，检测受体处上游 Gi 蛋白的活性。这种基于 HTRF 的非同位素测定方法操作简便、快速，且无需洗涤。该测定适用于 GPCR 模型研究以及化合物的药理学鉴定和表征。

工作原理
GTP Gi 结合测定原理
GTP Gi 结合测定使用隐窝标记的 GTP 类似物（供体）和 d2 标记的抗 Gi 抗体（受体）。GTP 类似物特异性结合到活性 G 蛋白的 GTP 结合口袋中，而 d2 标记的抗体则特异性针对 G 蛋白的 Gαi 亚基。在两种检测试剂存在的情况下，GPCR 被激活会使供体和受体靠近，从而触发 FRET 信号，其强度与样品中活性 Gi 蛋白的浓度成正比。GTPγS 是一种不可水解的 GTP 类似物，用于将供体从 GTP 结合口袋中置换出来并消除 FRET，以确定测定的非特异性信号并确保其准确性。

GTP Gi 结合板测定方案
GTP Gi 结合测定采用微型化形式，最终体积为 20μl，其特点是简化的 4 步试剂添加方案，依次添加刺激物 / 化合物、激动剂、检测试剂和膜。根据生物模型的不同，在室温下孵育 3 小时或过夜后读取平板数据。无需洗涤步骤。

该方案使用先前为目标生物模型确定的优化条件（最佳膜量 / 孔，以及补充了最佳浓度的 MgCl₂和 GDP 的刺激缓冲液 #3）。优化程序和建议在相关指南中给出。

测定验证
CHO-δ 阿片受体膜提取物中的药理学反应
使用该膜模型先前优化的条件进行测定：刺激缓冲液 #3 补充有 0.5μM 的 GDP、50mM 的 MgCl₂。测定中每孔使用 5μg 膜。SNC-162 的剂量 - 反应曲线拟合显示 EC50 为 6.5nM，与已发表的值一致。

GTP 结合测定的优化步骤要求
在 CHO-DOR 膜模型中进行的一项案例研究，研究了刺激缓冲液中 MgCl₂和 GDP 浓度优化与否的情况。将 5μg 膜在有或没有 SNC-162 激动剂（1μM）的情况下孵育。在室温下过夜孵育后读取平板数据。

未经优化时，该测定存在严重偏差，GPCR 基础活性和激动剂诱导活性之间的信号没有差异。优化步骤显著降低了基础活性信号，从而突出了激动剂诱导的信号，信噪比（S/B）达到 2.8。优化建议和程序在试剂盒相关指南的优化部分有详细描述。

GTP 结合测定的膜量优化步骤
每孔的最佳膜量可能因膜模型而异。额外的优化步骤包含三种条件（2.5、5 和 10μg / 孔），可用于确定最佳膜量。此处介绍两个案例研究：

CHO-DOR 膜模型（Gi 偶联受体）。测定在 50mM MgCl₂、0.5μM GDP 存在下进行，用 10μM 的 SNC-162 激动剂刺激。
HEK293-NTS1 膜模型（主要为 Gq 偶联受体，次要为 Gi 偶联）。测定在 50mM MgCl₂、不添加 GDP 的情况下进行，用 10μM 的神经降压素激动剂刺激。

图表显示了在没有（基础）或有激动剂（受刺激）的情况下获得的信号。每种条件下均给出信噪比（S/B）。如此处所示，每孔的膜量是药理学信噪比优化的关键参数。对于这两种模型，5μg 膜 / 孔是合适的。该优化步骤可能是提高测定信噪比或选择使用更低膜量（DOR 为 2.5μg / 孔）的测定条件的决定性因素。

简化途径
GTP 在 GPCR 信号通路中的作用
在非活性状态下，异源三聚体 G 蛋白在其 Ga 亚基的结合口袋中结合 GDP。当 GPCR 被激动剂刺激时，与受体偶联的 G 蛋白发生构象变化，使 Ga 亚基释放结合的 GDP 并替换为 GTP。这种核苷酸交换使 Ga 亚基完全激活，它与 Gb/Gg 二聚体分离，并根据其亚型（Gai、Gas、Gaq 等）对腺苷酸环化酶（AC）和磷脂酶 C（PLC）执行抑制或刺激功能。

接下来的信号转导步骤具有 GPCR 特异性，并调动不同的磷酸蛋白和通路。随着时间的推移，与 Ga 结合的 GTP 发生水解，使 Ga 蛋白回到非活性状态。

规格

其他规格
应用
第二信使检测
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
产品类别
试剂盒
样品体积
10μL
运输条件
干冰运输
目标类别
GPCR
技术
TR-FRET
治疗领域
心血管疾病
传染病
炎症
代谢 / 糖尿病
非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
神经科学
肿瘤学与炎症
罕见病
单位规格
500 个测定点

没有数据

货号：62GTPPEG

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