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HTRF GTP GI BIND. KIT - 100 PTS GTP Gi结合测试试剂盒 –100测试

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概述

GTP Gi 结合实验可检测膜提取物中 GPCR 受刺激时，受体上游的 Gi 蛋白活性。这种基于 HTRF 的非同位素实验操作简便、快速，且无需洗涤。该实验适用于 GPCR 模型研究，以及化合物的药理学鉴定和表征。

工作原理
GTP Gi 结合实验原理
GTP Gi 结合实验使用隐花青标记的 GTP 类似物（供体）和 d2 标记的抗 Gi 抗体（受体）。GTP 类似物能特异性结合到活性 G 蛋白的 GTP 结合口袋，而 d2 标记的抗体则特异性针对 G 蛋白的 Gαi 亚基。在两种检测试剂存在的情况下，GPCR 被激活会使供体和受体靠近，从而触发 FRET 信号，其强度与样品中活性 Gi 蛋白的浓度成正比。GTPγS 是一种不可水解的 GTP 类似物，它可将供体从 GTP 结合口袋中置换出来，并消除 FRET，以此确定实验的非特异性信号，确保实验的准确性。

GTP Gi 结合平板实验方案
GTP Gi 结合实验采用微型化形式，最终体积为 20μl，其特点是简化的 4 步试剂添加流程，依次添加刺激物 / 化合物、激动剂、检测试剂和膜。根据生物模型的不同，在室温下孵育 3 小时或过夜后读取平板数据。无需洗涤步骤。

该方案使用先前为目标生物模型确定的优化条件（最佳的每孔膜量，以及添加了最佳浓度的 MgCl₂和 GDP 的刺激缓冲液 #3）。优化步骤和建议详见相关指南。

实验验证
CHO 细胞系 -δ 阿片受体膜提取物中的药理学反应
本实验采用针对该膜模型预先优化的条件：刺激缓冲液 #3 中添加 0.5μM 的 GDP 和 50mM 的 MgCl₂。实验中每孔使用 5μg 膜。SNC-162 的剂量 - 反应曲线拟合显示其 EC50 为 6.5nM，与已发表的值一致。

GTP 结合实验的优化步骤要求
以 CHO-DOR 膜模型为例，研究刺激缓冲液中 MgCl₂和 GDP 浓度优化与否的情况。将 5μg 膜在存在或不存在 1μM SNC-162 激动剂的条件下孵育。平板在室温下过夜孵育后进行读数。

未经优化时，实验存在严重偏差，GPCR 基础活性和激动剂诱导活性之间的信号无差异。优化步骤显著降低了基础活性信号，从而突出了激动剂诱导的信号，信背比（S/B）达到 2.8。优化建议和步骤在试剂盒相关指南的优化部分有详细描述。

GTP 结合实验的膜量优化步骤
每孔的最佳膜量可能因膜模型而异。额外的优化步骤包含三种条件（2.5、5 和 10μg / 孔），可用于确定最佳膜量。以下为两个案例研究：

CHO-DOR 膜模型（Gi 偶联受体）。实验在 50mM MgCl₂、0.5μM GDP 存在的条件下进行，用 10μM SNC-162 激动剂刺激。
HEK293-NTS1 膜模型（主要为 Gq 偶联受体，次要为 Gi 偶联）。实验在 50mM MgCl₂、不添加 GDP 的条件下进行，用 10μM 神经降压素激动剂刺激。

图表显示了在不存在（基础）和存在激动剂（受刺激）时获得的信号。每种条件下均给出信背比（S/B）。如图所示，每孔的膜量是优化药理学信背比的关键参数。对于这两种模型，每孔 5μg 膜是合适的。该优化步骤可能是提高实验信背比或选择使用更低膜量（DOR 为 2.5μg / 孔）的实验条件的决定性因素。

简化通路
GTP 在 GPCR 信号通路中的作用
异源三聚体 G 蛋白在非活性状态下，其 Ga 亚基的结合口袋中结合着 GDP。当 GPCR 受到激动剂刺激时，与受体偶联的 G 蛋白发生构象变化，使 Ga 亚基释放结合的 GDP，并替换为 GTP。这种核苷酸交换使 Ga 亚基完全激活，它与 Gb/Gg 二聚体分离，并根据其亚型（如 Gai、Gas、Gaq 等）对腺苷酸环化酶（AC）和磷脂酶 C（PLC）执行抑制或刺激功能。

后续的信号转导步骤具有 GPCR 特异性，并涉及不同的磷酸蛋白和通路。随着时间的推移，与 Ga 结合的 GTP 发生水解，使 Ga 蛋白回到非活性状态。

规格

其他规格
应用
第二信使检测
品牌
HTRF
检测方式
HTRF
产品类别
试剂盒
样品体积
10μL
运输条件
干冰运输
目标类别
GPCR
技术
时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域
心血管疾病
传染病
炎症
代谢 / 糖尿病
非酒精性脂肪性肝炎 / 纤维化
神经科学
肿瘤学与炎症
罕见病
单位规格
100 个实验点

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货号：62GTPPET

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