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HTRF PWT BETA ARRESTIN 2

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概述

此编码 β- 抑制蛋白 2 的质粒旨在作为 HTRF β- 抑制蛋白 2 募集试剂盒（62BDBAR2PEB/C）和 HTRF 总 β- 抑制蛋白 2 细胞试剂盒（64BAR2TPEB/C）的配套产品。它能够在内源性 β- 抑制蛋白 2 水平较低的细胞系中过表达 β- 抑制蛋白 2，并有助于扩大检测窗口。特别建议在 CHO 细胞系中使用该质粒，因为 CHO 细胞系本身因该蛋白表达量低，在 β- 抑制蛋白募集检测中难以发挥作用。

工作原理
HTRF 野生型 β- 抑制素质粒转染原理
将表达 G 蛋白偶联受体（GPCR）的稳定 CHO 或 HEK293 细胞以 80,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

然后移除培养基，向每个孔中加入 50µL 脂质体与 DNA 在不含血清的 optiMEM 中的混合液。强烈建议测试 3 种不同用量的 β- 抑制蛋白 2 质粒，以确定 β- 抑制蛋白 2 募集试剂盒的最佳性能，例如 5、10 和 20 ng 的 β- 抑制蛋白 2 质粒。

在 37°C、5% CO₂条件下孵育 6 小时后，向每个孔中加入 100µL 含血清的培养基。

在 37°C、5% CO₂条件下再孵育 24 小时后，细胞即可用于各种检测。

我们建议在转染过程中使用两个不同的培养板。第一个培养板用于在经不同浓度化合物处理的细胞上进行 β- 抑制蛋白 2 募集检测（评估不同质粒用量下的检测窗口和半最大效应浓度（EC50））。第二个培养板用于进行 HTRF 总 β- 抑制蛋白 2 和 HTRF 总衔接蛋白 2（AP2）检测，评估转染后 β- 抑制蛋白 2 和 AP2 的表达水平。

检测验证
β- 抑制蛋白 2 募集检测的性能与转染到表达 NK2R 的 CHO 细胞中的野生型 β- 抑制蛋白 2 质粒用量的关系
将表达人 NK2 受体的稳定 CHO 细胞以 80,000 个细胞 / 孔的密度接种到两个不同的 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

然后按照上述方法用 0、5、10 和 20 ng 的 β- 抑制蛋白 2 质粒进行脂质体转染。

移除第一个培养板中的培养基，用 50 µL 裂解缓冲液在室温下轻轻振荡裂解细胞 30 分钟。使用补充的 1 号裂解缓冲液（1x）对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 纯样品和各稀释液转移到 384 孔小体积微孔板中，然后加入 4 µL HTRF 总 β- 抑制蛋白 2 检测试剂。在室温下孵育 3 小时后记录 HTRF 信号。

在第二个培养板中，用在 4 号刺激缓冲液中稀释的不同浓度的神经激肽 A 在室温下处理细胞 30 分钟。然后移除培养基，用 30 µL 1 号稳定缓冲液在室温下稳定细胞 15 分钟，随后用 100µL 1 号洗涤缓冲液洗涤 3 次。最后，加入 100µL β- 抑制蛋白 2 募集检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号（检测方案选项 1 和 2）。

β- 抑制蛋白 2 检测显示，信号随转染的 β- 抑制蛋白 2 DNA 用量增加而增强。计算得到的 Delta F 值在推荐范围内（即 1500% 至 4000%），这为 β- 抑制蛋白 2 募集检测提供了最佳的检测窗口（信号背景比（S/B））。此外，神经激肽 A 的 EC50 与文献一致，且由于 β- 抑制素质粒的过表达，信号背景比得到显著改善。

Delta F	未转染（NT）	5 ng β- 抑制蛋白 2	10 ng β- 抑制蛋白 2	20 ng β- 抑制蛋白 2
纯样品	267%	1608%	2660%	3819%
1/2 稀释	199%	871%	1328%	2992%

β- 抑制蛋白 2 募集检测	未转染（NT）	5 ng β- 抑制蛋白 2	10 ng β- 抑制蛋白 2	20 ng β- 抑制蛋白 2
EC50（nM）	2.4	3.2	1.3	1.7
方案选项 1 的信号背景比	-	2.60	2.31	2.34
相对于未转染的信号背景比增加百分比	1.18	120%	95%	98%
方案选项 2 的信号背景比	-	3.68	2.90	3.21
相对于未转染的信号背景比增加百分比	1.36	170%	113%	135%

在转染野生型 β- 抑制蛋白 2 质粒的表达人 GLP1R 的 HEK 和 CHO 细胞上进行的 β- 抑制蛋白 2 募集检测
将表达人 GLP1 受体的稳定 CHO 或 HEK293 细胞以 80,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

然后按照上述方法用 5、10 和 20 ng 的 β- 抑制蛋白 2 质粒进行脂质体转染。

用在 4 号刺激缓冲液中稀释的不同浓度的艾塞那肽 - 4 在室温下处理细胞 30 分钟后，移除培养基。用 30 µL 1 号稳定缓冲液在室温下稳定细胞 15 分钟，随后用 100µL 1 号洗涤缓冲液洗涤 3 次。最后，加入 100µL β- 抑制蛋白 2 募集检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号（检测方案选项 1 和 2）。

结果展示了为每个细胞系提供最佳信号背景比的 β- 抑制蛋白 2 DNA 用量，即 HEK293 GLP1 细胞系为 20 ng，CHO GLP1 细胞系为 5 ng。在这两种情况下，转染使信号背景比提高了约 30%。

	β- 抑制蛋白 2 募集检测	未转染（NT）	5 ng β- 抑制蛋白 2	20 ng β- 抑制蛋白 2	相对于未转染的信号背景比增加百分比
HEK GLP1R	EC50（nM）	18	不适用（NA）	22	-
	方案选项 1 的信号背景比	2.4	不适用（NA）	2.9	21%
CHO GLP1R	EC50（nM）	4.3	5.6	不适用（NA）	-
	方案选项 1 的信号背景比	1.2	1.6	不适用（NA）	31%

在转染野生型 β- 抑制蛋白 2 质粒的表达 MOR 的 CHO 细胞上进行的 β- 抑制蛋白 2 募集检测
将表达人 MOR 受体的稳定 CHO 细胞以 80,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时。

然后按照上述方法用 5、10 和 20 ng 的 β- 抑制蛋白 2 质粒进行脂质体转染。

用在 4 号刺激缓冲液中稀释的不同浓度的 DAMGO 在室温下处理细胞 30 分钟后，移除培养基。用 30µL 1 号稳定缓冲液在室温下稳定细胞 15 分钟，随后用 100µL 1 号洗涤缓冲液洗涤 3 次。最后，加入 100µL β- 抑制蛋白 2 募集检测试剂。在室温下孵育过夜后记录 HTRF 信号（检测方案选项 1 和 2）。

结果展示了为该细胞系提供最佳信号背景比的 β- 抑制蛋白 2 DNA 用量，即在本实验中为 5 ng。在这种情况下，转染使信号背景比提高了 30%-40%。

β- 抑制蛋白 2 募集检测	未转染（NT）	5 ng β- 抑制蛋白 2	相对于未转染的信号背景比增加百分比
方案 2 的信号背景比	1.3	2	43%
EC50（nM）	85	110	-

规格参数

其他规格

应用：第二信使检测
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
产品类别：荧光试剂
运输条件：干冰运输
靶标类别：G 蛋白偶联受体（GPCR）
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：3 瓶

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货号：PWTBARR2

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