产品概述

增殖相关核抗原 Ki-67（又称 Ki67 或 MKI67）的表达是细胞增殖的标志物，仅在分裂细胞中可检测到。Ki-67 是一种非组蛋白，属于核基质相关增殖抗原，存在于整个细胞周期中，但不存在于静息期细胞（G0 期）。它在常规病理学中被广泛用作增殖标志物，用于检测人类肿瘤中的细胞增殖分数。增殖细胞核内的 Ki-67 蛋白会在细胞裂解后释放，裂解液中提取的 Ki-67 蛋白可通过本 Ki-67 HTRF 试剂盒进行定量。该 Ki-67 定量实验可替代 BrdU 或 EdU 掺入实验，后两者是通过外源性增殖标志物掺入分裂细胞新合成 DNA 来检测增殖的方法。Ki-67 的应用范围与增殖细胞核抗原（PCNA）类似。

工作原理

检测原理

Ki-67 定量试剂盒基于双抗夹心形式，涉及两种特异性抗体，分别标记穴状化合物（供体）和 d2（受体）。增殖细胞核内的 Ki-67 蛋白经提取后，会与抗 Ki-67 铕穴状化合物单克隆抗体和抗 Ki-67 d2 偶联单克隆抗体结合。当两种染料近距离接触时，用光源（激光或闪光灯）激发供体，会触发向受体的荧光共振能量转移（FRET），受体进而在特定波长（665 纳米）下发出荧光。特异性信号随 Ki-67 浓度的增加而正向变化。（图示：assay-principle-human-ki-67-64ki67peg-64ki67peh，Ki-67 检测原理相关图示）

检测方案

检测采用 384 孔小体积白色板或 Cisbio 低体积 96 孔板（最终反应体积 20 微升），操作流程如下：向板中直接加入 4 微升样本（裂解液）+12 微升裂解缓冲液，或 16 微升标准品，随后使用 HTRF 试剂进行检测。标记 HTRF 供体和受体的抗体可预先混合，通过单次加样步骤加入，进一步简化检测流程。通过按比例调整各试剂的添加体积，检测可在 96 孔至 384 孔板中进行。（图示：assay-protocol-human-ki-67-64ki67peg-64ki67peh，Ki-67 检测方案相关图示）

检测详情

技术参数

• 标准曲线：2.05–500 pg/mL
• 检测限（LoD）：0.41 pg/mL
• 检测范围（LoD - IC90）：1.63–500 pg/mL
• 特异性：人源 Ki-67

（图示：assay-validation-ki67-4，Ki-67 检测验证相关图示）

检测验证

血清饥饿细胞经 10% FCS 刺激 / 再喂养 24 小时后的 Ki-67 蛋白表达

采用血清饥饿再喂养实验，利用人肺癌组织来源的上皮 A549 细胞系模拟细胞周期。首先，使用不含 FCS 的 Ham's F-12 培养基（添加 0.5% 培养级牛血清白蛋白）孵育 A549 细胞 72 小时以实现同步化（每孔 6×10⁴或 1.2×10⁵个细胞，100 微升培养基）。随后，6 孔细胞更换为完全培养基（含 10% FCS），另外 6 孔作为饥饿对照组。在第一块微孔板中，移除培养基，用 50 微升 1X 裂解缓冲液裂解细胞，取 4 微升裂解液转移至 384 孔白色微孔板，加入 12 微升 1X 裂解缓冲液，按照 Ki-67 HTRF 试剂盒流程进行检测。在第二块微孔板中平行进行相同实验，使用商用 BrdU 酶联免疫吸附测定试剂盒进行 BrdU 掺入实验对比。简要步骤：孵育 2 小时后加入 BrdU（每孔 10 微升），移除培养基，固定细胞并封闭（1% 牛血清白蛋白孵育 30 分钟），加入抗 BrdU 过氧化物酶偶联物（室温孵育 90 分钟），随后进行洗涤和显色步骤。结果显示：与饥饿对照组相比，经 FCS 刺激的细胞裂解液中 Ki-67 表达升高；同时，FCS 刺激组的 BrdU 掺入量也增加，Ki-67 表达与 BrdU 掺入实验结果具有相关性。值得注意的是，Ki-67 HTRF 实验的检测窗口比 BrdU 实验更大。（图示：assay-validation-ki67-1、assay-validation-ki67-2，血清饥饿再喂养实验相关图示）

汇合与非汇合 A549 肿瘤细胞中 Ki-67 蛋白的差异表达

通过两次独立实验验证：将 A549 细胞接种到两个 T175 培养瓶的 Ham's F-12 完全培养基（含 10% FCS）中，采用两种接种浓度分别获得汇合细胞和非汇合细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞，加入 5 毫升细胞解离缓冲液解离，用橡胶刮棒刮取细胞，转移至三个 1.5 毫升微量离心管中（每管 1×10⁶个细胞，作为技术重复）。离心（5 分钟，400 相对离心力）后，用 500 微升 4 号裂解缓冲液裂解细胞沉淀（室温涡旋 30 分钟）。裂解液用 1X 裂解缓冲液稀释 20 倍，取 16 微升稀释后的裂解液（设置三个复孔）转移至 384 孔小体积白色微孔板，进行 Ki-67 HTRF 检测。结果显示：非汇合 A549 细胞的 Ki-67 表达明显高于汇合细胞。（图示：assay-validation-ki67-3，汇合与非汇合细胞实验相关图示）

产品规格

其他规格

• 应用领域：Protein Quantification
• 品牌：HTRF
• 检测方式：HTRF
• 产品类别：Kit
• 样本体积：4 µL
• 运输条件：干冰运输
• 靶标类别：Biomarkers
• 靶标物种：人
• 技术平台：TR-FRET
• 治疗领域：Oncology & Inflammation
• 单位规格：500 assay points