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HTRF STAT3 P-Y705 KIT - 500 PTS 磷酸化STAT3(Y705)检测试剂盒 - 500测试

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概述

这种基于 HTRF 的细胞检测方法能够快速、定量检测 Tyr705 位点磷酸化的 STAT3，以此作为 JAK/STAT 信号通路活性的读数。STAT3 在多种癌症中呈上调状态，使其成为抗癌研究的有力工具。

工作原理

磷酸化 STAT3（Tyr705）检测原理

磷酸化 STAT3（Tyr705）检测用于测量 Tyr705 位点磷酸化的 STAT3。与 Western Blot 不同，该检测完全基于微孔板，无需凝胶、电泳或转膜步骤。检测使用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则识别蛋白质本身而不依赖其磷酸化状态。蛋白质磷酸化促使两种标记抗体形成免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团紧密靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样本中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，可在无需洗涤的检测模式下评估蛋白质的磷酸化状态。

磷酸化 STAT3（Tyr705）双板检测流程

双板流程包括：先在 96 孔板中培养细胞，裂解后将裂解物转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 STAT3（Tyr705）HTRF 检测试剂。该流程可监测细胞活力和汇合度。

磷酸化 STAT3（Tyr705）单板检测流程

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT3（Tyr705）可在同一板中完成细胞培养、刺激和裂解，无需洗涤步骤。这种高通量筛选（HTS）设计的流程在实现微型化的同时，仍能保持 HTRF 的稳健检测质量。

检测验证

HTRF 与 Western Blot 在磷酸化 STAT3 检测中的对比

HeLa 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养 2 天，用 5nM IFNa 刺激 15 分钟。弃去细胞培养基，加入 3ml 裂解缓冲液孵育 45 分钟，离心 10 分钟后收集可溶性上清液。取等量裂解物同时进行 WB 和 HTRF 对比检测。两种方法显示出相当的灵敏度（750 个细胞），而 HTRF 相比 Western Blot 操作更便捷。

IL6 对 NIH 3T3 细胞的剂量反应

将鼠源 NIH 3T3 细胞（100,000 细胞 / 孔）在 37°C 下用不同浓度 IL6 刺激 30 分钟，裂解孵育 30 分钟后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）细胞检测试剂盒的双板流程测量磷酸化 STAT3。

JAK 抑制剂对 HeLa 细胞的抑制作用

HeLa 细胞（100,000 细胞 / 孔）在 37°C 下与不同浓度拮抗剂孵育 1 小时，随后加入激动剂（IFNα）孵育 30 分钟。裂解孵育 30 分钟后，使用 HTRF 磷酸化 STAT3（Tyr705）细胞检测试剂盒的双板流程测量磷酸化 STAT3。

使用 HTRF 总 STAT3 检测验证 STAT3 磷酸化状态

使用磷酸化 STAT3（Tyr705）和总 STAT3 检测的双板流程，用 IFNα 激活 HeLa 细胞（100,000 细胞 / 孔）15 分钟。结果显示，IFNα 刺激后 STAT3 磷酸化呈剂量依赖性增加，而 STAT3 表达水平保持恒定。

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