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HTRF STAT5 P-Y694 KIT - 10K PTS 磷酸化STAT5测量试剂盒 -10,000测试

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概述

磷酸化 STAT5（Tyr694）试剂盒旨在稳健高效地监测 STAT5 在 Tyr694 位点的磷酸化情况，以此作为 JAK/STAT 通路激活的检测指标。该磷酸化 STAT5 试剂盒采用优化且简化的 “混合即读” 免洗涤方案，包含研究所需的全部试剂，能让实验更快速、高效地进行。

工作原理
磷酸化 STAT5（Tyr694）检测原理
磷酸化 STAT5（Tyr694）检测用于测定在 Tyr694 位点发生磷酸化的 STAT5。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 STAT5（Tyr694）检测采用两种标记抗体：一种标记有供体荧光团，另一种标记有受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质磷酸化状态提供了手段。

1phospho-how-it-works-phospho-stat5-tyr694-assay-principle.svg（磷酸化 STAT5（Tyr694）检测原理示意图）

磷酸化 STAT5（Tyr694）双板检测方案
双板方案的流程为：先在 96 孔板中培养细胞，待细胞裂解后，将裂解液转移至 384 孔低体积检测板，再加入磷酸化 STAT5（Tyr694）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

2biomarkers-how-it-works-assay-protocol-alpha-tubulin-63adk072peg-63adk072peh.svg（双板检测方案示意图）

磷酸化 STAT5（Tyr694）单板检测方案
使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT5（Tyr694）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现实验微型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

2phospho-how-it-works-total-btk-1-plate-assay-protocol.svg（单板检测方案示意图）

检测验证

使用磷酸化 STAT5（Tyr694）试剂盒进行 HTRF 与蛋白质印迹法的比较
将 TF1 细胞在 T175 培养瓶中于 37°C 培养，直至细胞浓度达到 1.5×10⁶个 /ml 培养基，然后用 IL3 刺激 10 分钟。细胞孵育 30 分钟后裂解。通过 HTRF 和蛋白质印迹法对系列稀释液（1:2）进行平行分析。请注意，128KC 大致相当于 32μg 蛋白质。使用 HTRF 磷酸化 STAT5（Tyr694）检测时，仅需 2000 个细胞即可检测到最低信号，而蛋白质印迹法则需要 8000 个细胞才能产生信号。HTRF 检测的灵敏度至少是蛋白质印迹法的 4 倍，且两者具有良好的相关性。

2assay-validation-stat5-phospho-y694-1.svg（验证示意图 1）
3assay-validation-stat5-phospho-y694-2.svg（验证示意图 2）

使用磷酸化 STAT5（Tyr694）试剂盒进行 HTRF 检测与 ELISA 的比较
培养 TF1 细胞，用不同浓度的 JAK 抑制剂处理后，再用 IL3 刺激 10 分钟。裂解后，通过 HTRF 和 ELISA 对收集的上清液系列稀释液进行平行分析。图表结果显示，在检测 STAT5 磷酸化方面，HTRF 比 ELISA 灵敏度更高、检测窗口更大、重现性更好。尽管 ELISA 与 HTRF 具有良好的相关性，但 HTRF 的整体性能更优。

4assay-validation-stat5-phospho-y694-3.svg（比较示意图）

采用双板检测方案的 TF1 细胞药理学响应
将 TF1 细胞接种在 25μl 细胞培养基中，用 5μl 不同浓度的 JAK 抑制剂来他替尼处理 30 分钟。移除细胞培养基后，加入 10μl 4× 补充裂解缓冲液，孵育 30 分钟后加入 HTRF 检测试剂。将 16μl 裂解液转移至 384 孔低体积白色板中，分析 STAT5 的磷酸化情况。结果清楚表明，该检测具有高灵敏度，可使用低至 1/4 数量的细胞，且检测窗口无显著降低。

5assay-validation-stat5-phospho-y694-4.svg（响应示意图 1）

6assay-validation-stat5-phospho-y694-6.svg（响应示意图 2）

采用双板检测方案的 HeLa 细胞药理学响应
将 100K HeLa 细胞接种在 25μl 细胞培养基中，用 5μl 不同浓度的 JAK 抑制剂来他替尼处理 2 小时，然后用 20nM 干扰素（IFN）刺激 10 分钟。移除细胞培养基后，加入 10μl 4× 补充裂解缓冲液，孵育 30 分钟后加入 HTRF 检测试剂。将 16μl 裂解液转移至 384 孔低体积白色板中，分析 STAT5 的磷酸化情况。

7assay-validation-stat5-phospho-y694-5.svg（响应示意图 3）

简化通路

STAT5 细胞信号通路
Stat5 蛋白的激活广泛由细胞因子和其他生长因子介导，能够实现信号从细胞膜到细胞核的快速传递。这些 STAT 蛋白以细胞因子特异性的方式调控靶基因的表达。除了被细胞因子激活外，Stat5a 和 Stat5b 的活性还受 CIS/SOCS/SSI 蛋白的负调控。JAK/STAT 通路的激活需要配体与受体结合，进而激活 Janus 激酶（JAKs）—— 一类胞内酪氨酸激酶。通过磷酸化下游的信号转导子和转录激活子（STAT），STAT5 形成同源或异源二聚体以被激活并转运至细胞核，在那里与 STAT5 应答元件结合，诱导特定基因集的转录。

8phospho-pathway-stat5-tyr694-64at5peg-64at5peh-64at5pey.svg（通路示意图）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样本体积：16μl
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：感染性疾病、神经科学、肿瘤与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64AT5PEH

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