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HTRF STAT6 P-Y641 KIT - 10K PTS 磷酸化STAT6(Y641)检测试剂盒 - 10,000测试

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概述

本细胞检测试剂盒旨在监测 STAT6 在酪氨酸 641（Tyr641）位点的磷酸化，这是其激活的标志性事件。

STAT6 是一种转录因子，主要由白细胞介素 4（IL4）受体激活，也可由 IL3、IL13 或干扰素 α（IFNα）受体激活。Janus 激酶使 STAT6 的酪氨酸 641 位点磷酸化，进而形成同源二聚体或与 STAT2 形成异源二聚体。最终，激活的 STAT6 转运至细胞核，介导细胞因子诱导的基因表达。

工作原理

磷酸化 STAT6（Tyr641）检测原理

磷酸化 STAT6（Tyr641）检测用于测定在 Tyr641 位点发生磷酸化的 STAT6。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 STAT6（Tyr641）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质磷酸化状态提供了便捷方式。

1phospho-how-it-works-phospho-stat6-y641-assay-principle.svg（磷酸化 STAT6（Tyr641）检测原理示意图）

磷酸化 STAT6（Tyr641）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，最后加入磷酸化 STAT6（Tyr641）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Two-plate protocol of the HTRF total BRD2 assay（HTRF 总 BRD2 检测的双板方案示意图参考）

磷酸化 STAT6（Tyr641）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 STAT6（Tyr641）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

One-plate protocol of the HTRF total BRD2 assay（HTRF 总 BRD2 检测的单板方案示意图参考）

检测验证

多种细胞模型中 STAT6 Tyr641 磷酸化的评估

将多种人类细胞系（包括贴壁的 HeLa 细胞和悬浮细胞，如 TF1、U937 和 TH1 细胞）以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔微孔板中，然后用 5ng/mL 的人 IL4 刺激 20 分钟。用补充的裂解缓冲液裂解细胞后，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

4assay-validation-stat6-phospho-y641-1.svg（验证示意图 1）

THP1 细胞中磷酸化 STAT6（Tyr641）的药理学验证

将 THP1 细胞以不同密度接种到 96 孔微孔板中，然后用不同浓度的人 IL4 刺激 20 分钟。按照双板检测方案，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

5assay-validation-stat6-phospho-y641-2.svg（验证示意图 2）

干扰素 α 诱导的 STAT6 磷酸化剂量反应

将 THP1 细胞以不同密度接种到 96 孔微孔板中，然后用不同浓度的人 IFNα 刺激 20 分钟。按照双板检测方案，将 16µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测试剂。孵育过夜后记录 HTRF 信号。

6assay-validation-stat6-phospho-y641-3.svg（验证示意图 3）

HTRF 磷酸化 STAT6 细胞检测与蛋白质印迹法的比较

将人 HeLa 细胞接种到 T175 培养瓶中，在 37°C、5% CO₂条件下培养至汇合。然后用 50ng/mL 的 IL4 处理细胞 20 分钟，随后裂解。用补充的裂解缓冲液对细胞裂解物进行系列稀释，将 16µL 各稀释液转移至低体积白色微孔板中，再加入 4µL HTRF 磷酸化 STAT6 检测试剂。取等量裂解物，采用 HTRF 与蛋白质印迹法进行平行比较。使用 HTRF 磷酸化 STAT6（Tyr641）检测时，每孔 5,000 个细胞即可检测到信号，而蛋白质印迹法（ECL 检测）则需要 40,000 个细胞。结果表明，HTRF 磷酸化 STAT6 检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 8 倍。

7assay-validation-stat6-phospho-y641-4.svg（比较示意图）

简化通路

STAT6 的功能与调控

细胞因子和生长因子通过受体相关激酶 JAK 使 STAT6 磷酸化。磷酸化后的 STAT6 形成同源二聚体或异源二聚体，并转运至细胞核，介导细胞因子诱导的基因表达。白细胞介素 4 是触发 STAT6 酪氨酸 641 位点磷酸化的主要细胞因子，可诱导 BCL2L1/BCL-X (L) 的表达，而该基因与 IL4 的抗凋亡活性相关。此外，TBK1 介导的 STAT6 磷酸化与 STING 通路相关，在病毒感染引发的先天免疫中发挥作用。

8phospho-pathway-stat6-phospho-y641-kit-64at6peghy.svg（通路示意图）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液、5 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
治疗领域：感染性疾病、肿瘤与炎症
单位规格：10,000 个检测点

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货号：64AT6PEH

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