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HTRF (H/M) ATG14 P-S29 KIT - 500 PTS HTRF人源/鼠源磷酸化自噬相关蛋白14 (丝氨酸29)检测试剂盒，500测试

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概述

ATG14，即自噬相关蛋白 14，也被称为 BAKOR（Beclin 1 相关自噬关键调节因子），是巨自噬中自噬体成核步骤的关键参与者。在细胞应激时，营养 / 能量敏感传感器 mTOR 和 AMPK 会激活 ULK1 复合物，该复合物可使 ATG14 的丝氨酸 29（Ser29）位点发生磷酸化，进而激活下游的 PIK3C3 自噬体成核复合物。

工作原理

HTRF 磷酸化 ATG14 检测原理

HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）检测用于测定 Ser29 位点磷酸化的 ATG14。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。磷酸化 ATG14（Ser29）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质磷酸化状态提供了手段。

1phospho-how-it-works-atg14-phospho-assay-principle.svg（HTRF 磷酸化 ATG14 检测原理示意图）

HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，最后加入磷酸化 ATG14（Ser29）HTRF 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

2phospho-how-it-works-atg14-phospho-assay-protocol-01.svg（HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）双板检测方案示意图）

HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ATG14（Ser29）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

3phospho-how-it-works-atg14-phospho-assay-protocol-02.svg（HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）单板检测方案示意图）

检测验证

利用 ULK1/2 和 mTORC1 抑制剂在人 HCT116 细胞系中验证磷酸化 ATG14（Ser29）和总 ATG14 试剂盒

将人 HCT116 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 MRT68921 的浓度梯度处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，先加入 2µL 激活缓冲液，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）或总 ATG14 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如预期所示，MRT68921 是一种强效的双重自噬激酶 ULK1/2 抑制剂，它会抑制 ULK1 的激活，减少自噬起始机制，导致 ATG14 磷酸化呈剂量依赖性降低，而对总 ATG14 蛋白的表达水平无影响。

将人 HCT116 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 AZD2014（Vistusertib）的浓度梯度处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，先加入 2µL 激活缓冲液，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）或总 ATG14 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。

如预期所示，AZD2014 是一种强效的 mTOR 抑制剂，它会减轻对 ULK1 的抑制，增强自噬起始机制，导致 ATG14 的 Ser29 位点磷酸化增加，而对总 ATG14 蛋白的表达水平无影响。

4assay-validation-atg14-phospho-pharmaco-1-1.svg（验证示意图 1）
5assay-validation-atg14-phospho-pharmaco-1-2.svg（验证示意图 2）

利用 ATG14 敲除 HAP1 细胞验证 HTRF 磷酸化 ATG14 检测的特异性

使用磷酸化（Ser29）HTRF 试剂盒评估野生型（WT）和 ATG14 敲除（KO）的 HAP1 细胞中人源性基础磷酸化（Ser29）ATG14 的表达水平。使用 GAPDH 管家基因 HTRF 试剂盒进行标准化。将细胞系在培养瓶中于 37°C、5% CO₂条件下培养，移除培养基后，每 1000 万个细胞加入 1mL 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，先加入 2µL 激活缓冲液，再加入 4µL HTRF 磷酸化 ATG14（Ser29）检测试剂。对于 GAPDH 检测，将 8µL 裂解物用 60µL 稀释剂预稀释，然后将 16µL 稀释后的样品与 4µL GAPDH 检测试剂混合。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。在 HAP1 ATG14 敲除细胞中，HTRF 信号与非特异性信号相当（未显示），表明 ATG14 基因被完全沉默，从而证明 HTRF 磷酸化（Ser29）ATG14 试剂盒对 ATG14 蛋白具有特异性。应用 GAPDH 标准化是为了考虑亲本细胞和敲除细胞之间轻微的生长差异（此处呈现磷酸化 ATG14 与 GAPDH 的比值）。HAP1 ATG14 敲除（1bp 缺失）细胞系来自 Horizon Discovery # HZGHC024663c012，HAP1 野生型来自 Horizon Discovery # C631。

6assay-validation-atg14-phospho-pharmaco-2-1.svg（特异性验证示意图）

简化通路

巨自噬中的 ATG14 信号通路

细胞自噬是一种特殊的降解和循环过程，对细胞稳态至关重要，可在多种应激条件下被激活。自噬分为 3 种类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬通路涉及几个关键步骤：起始、成核、吞噬泡复合物的延伸，然后通过 LC3-PE 募集来封存细胞质 cargo，随后与溶酶体融合导致 cargo 降解。

自噬体的生物发生由所谓的自噬相关蛋白（ATGs）的有序协同作用控制，这些蛋白被激活并募集到内质网和自噬体膜上。ULK1 复合物的募集是起始步骤中的第一个事件。ULK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，与 Atg13、Atg101 和 FIP200 蛋白形成复合物。该复合物是核心自噬机制中最上游的组件，因此是哺乳动物细胞自噬的关键启动子。ULK1 受关键的营养 / 能量敏感激酶 mTOR 和 AMPK 调控，这两种激酶都能使 ULK1 的 Ser317 和 Ser556 位点磷酸化，并直接调节其激酶活性。

激活的 ULK1 复合物通过 Atg13 与 ATG14 结合，并使 ATG14 的 Ser29 位点磷酸化。磷酸化激活的 ATG14 的激酶活性会刺激 PIK3C3 复合物的其他蛋白（成核），该复合物负责将磷脂酰肌醇（PI）磷酸化为磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI3P）这一关键步骤。这进而负责初始吞噬体膜结构的形成，随后通过其他 ATG 蛋白（ATG16/12/5 复合物）固定 LC3-II，从而为延伸和闭合步骤提供支持。

这意味着 ATG14 蛋白在 Ser29 位点的磷酸化是巨自噬过程中成核步骤启动的关键早期标志物。

7pathway-atg14.svg（ATG14 信号通路示意图）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

没有数据

货号：64ATG14S9PEG

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