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HTRF (H) ATG14 TOTAL KIT - 500 PTS HTRF总自噬相关蛋白14检测试剂盒，500测试

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概述

ATG14，即自噬相关蛋白 14，也被称为 BAKOR（Beclin 1 相关自噬关键调节因子），是巨自噬中自噬体成核步骤的关键参与者。在细胞应激时，营养 / 能量敏感传感器 mTOR 和 AMPK 会激活 ULK1 复合物，该复合物可使 ATG14 的丝氨酸 29（Ser29）位点发生磷酸化，进而激活下游的 PIK3C3 自噬体成核复合物。

工作原理

总 ATG14 检测原理

总 ATG14 检测用于定量细胞裂解物中 ATG14 的表达水平。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。总 ATG14 检测采用两种标记抗体：一种偶联供体荧光团，另一种偶联受体荧光团。两种抗体均对该蛋白质上的特定表位具有高度特异性。当细胞提取物中存在 ATG14 时，加入这些偶联物会使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质表达水平提供了手段。

1phospho-how-it-works-atg14-total-assay-principle.svg（总 ATG14 检测原理示意图）

总 ATG14 双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至低体积检测板（HTRF 384 孔低体积板或 96 孔低体积板）中，最后加入 HTRF 总 ATG14 检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

2phospho-how-it-works-atg14-phospho-assay-protocol-01.svg（总 ATG14 双板检测方案示意图）

总 ATG14 单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测总 ATG14 可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

3phospho-how-it-works-atg14-phospho-assay-protocol-02.svg（总 ATG14 单板检测方案示意图）

检测验证

利用 ULK1/2 抑制剂在人 HCT116 细胞系中验证总 ATG14 和磷酸化 ATG14（Ser29）试剂盒

将人 HCT116 细胞以 200,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔培养处理板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 MRT68921 的浓度梯度处理细胞 4 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25µl 补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，先加入 2µL 激活缓冲液，再加入 4µL HTRF 总 ATG14 或磷酸化 ATG14（Ser29）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。如预期所示，MRT68921 是一种强效的双重自噬激酶 ULK1/2 抑制剂，它会抑制 ULK1 的激活，减少自噬起始机制，导致 ATG14 磷酸化呈剂量依赖性降低，而对总 ATG14 蛋白的表达水平无显著影响。

2assay-validation-atg14-total-pharmaco-1.svg（验证示意图 1）

HTRF 总 ATG14 检测在人细胞系中的通用性

将多种人细胞系的细胞以不同密度培养，并用补充的 4 号裂解缓冲液（LB4）裂解。移除培养基后，加入适量补充的 4 号裂解缓冲液（1X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 14µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，先加入 2µL 激活缓冲液，再加入 4µL HTRF 总 ATG14 检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。如预期所示，总 ATG14 检测可检测到人源蛋白，多个人类细胞系中均显示出显著的阳性信号，这证明了该检测的通用性。

3assay-validation-atg14-phospho-pharmaco-2.svg（通用性验证示意图）

简化通路

巨自噬中的 ATG14 信号通路

细胞自噬是一种特殊的降解和循环过程，对细胞稳态至关重要，可在多种应激条件下被激活。自噬分为 3 种类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬通路涉及几个关键步骤：起始、成核、吞噬泡复合物的延伸，然后通过 LC3-PE 募集来封存细胞质 cargo，随后与溶酶体融合导致 cargo 降解。

自噬体的生物发生由所谓的自噬相关蛋白（ATGs）的有序协同作用控制，这些蛋白被激活并募集到内质网和自噬体膜上。ULK1 复合物的募集是起始步骤中的第一个事件。ULK1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，与 Atg13、Atg101 和 FIP200 蛋白形成复合物。该复合物是核心自噬机制中最上游的组件，因此是哺乳动物细胞自噬的关键启动子。ULK1 受关键的营养 / 能量敏感激酶 mTOR 和 AMPK 调控，这两种激酶都能使 ULK1 的 Ser317 和 Ser556 位点磷酸化，并直接调节其激酶活性。

激活的 ULK1 复合物通过 Atg13 与 ATG14 结合，并使 ATG14 的 Ser29 位点磷酸化。磷酸化激活的 ATG14 的激酶活性会刺激 PIK3C3 复合物的其他蛋白（成核），该复合物负责将磷脂酰肌醇（PI）磷酸化为磷脂酰肌醇 - 3 - 磷酸（PI3P）这一关键步骤。这进而负责初始吞噬体膜结构的形成，随后通过其他 ATG 蛋白（ATG16/12/5 复合物）固定 LC3-II，从而为延伸和闭合步骤提供支持。

因此，ATG14 蛋白在 Ser29 位点的磷酸化是巨自噬过程中成核步骤启动的关键早期标志物。

4pathway-atg14-total.svg（ATG14 信号通路示意图）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：总蛋白
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64ATG14TPEG

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