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HTRF (H/M) ATG16L1 P-S278 KIT - 500 PTS HTRF人源/鼠源磷酸化自噬相关16样蛋白1(丝氨酸278)检测试剂盒，500测

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概述

自噬相关 16 样蛋白 1（ATG16L1）是自噬过程中一种必不可少的蛋白质。ATG16L1 会被募集到吞噬泡上，并将 ATG5-ATG12 复合物募集至吞噬泡，从而促进 LC3 的脂化（从 LC3-I 向 LC3-II 转化），并有助于自噬体的成熟。

丝氨酸 278（Ser278）位点磷酸化的 ATG16L1 仅存在于新形成的自噬体上，因此对其进行定量可作为自噬囊泡形成和自噬诱导的理想替代指标。ATG16L1 与阿尔茨海默病、结直肠癌、心脏病、乳腺癌和慢性髓系白血病等疾病相关。

工作原理

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测原理

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测用于测定 Ser278 位点磷酸化的 ATG16L1。与蛋白质印迹法（Western Blot）不同，该检测完全基于微孔板进行，无需凝胶、电泳或转膜步骤。HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测采用两种标记抗体：一种标记供体荧光团，另一种标记受体荧光团。第一种抗体经筛选可特异性结合蛋白质上的磷酸化基序，第二种抗体则能识别该蛋白质，且不受其磷酸化状态影响。蛋白质磷酸化会促使形成包含两种标记抗体的免疫复合物，使供体荧光团与受体荧光团靠近，从而产生 FRET 信号。信号强度与样品中磷酸化蛋白质的浓度直接成正比，为在免洗涤检测格式中评估蛋白质磷酸化状态提供了手段。

phospho-how-it-works-phospho-btk-tyr223-a1.svg（示意图）

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）双板检测方案

双板方案包括：先在 96 孔板中培养细胞，然后裂解细胞，再将裂解物转移至 384 孔低体积检测板中，最后加入 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂。该方案能够监测细胞的活力和汇合度。

Two-plate protocol of the HTRF total BRD2 assay（HTRF 总 BRD2 检测的双板方案示意图参考）

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）单板检测方案

使用 HTRF 试剂检测磷酸化 ATG16L1（Ser278）可在单个培养板中完成，该培养板同时用于细胞培养、刺激和裂解。无需洗涤步骤。这种为高通量筛选（HTS）设计的方案可实现小型化，同时保持稳定的 HTRF 检测质量。

One-plate protocol of the HTRF total BRD2 assay（HTRF 总 BRD2 检测的单板方案示意图参考）

检测验证

不同细胞密度下人 PC-3 细胞中磷酸化 ATG16L1（Ser278）水平的检测

将人 PC-3 细胞以不同密度接种到 96 孔板中。在 37°C、5% CO₂条件下孵育 24 小时后，用 2.5 µM 的 mTOR 抑制剂 AZD2014 处理细胞 3 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25 µl 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 1 小时裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测仅需每孔 25,000 个 PC-3 细胞即可正确检测到磷酸化 ATG16L1（Ser278）（信噪比 > 3）。选择 100,000 个细胞 / 孔的密度进行药理学验证。

1assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-1-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（验证示意图 1）

利用 mTOR 和 ULK1/2 抑制剂在人 U-87 MG 细胞系中验证 HTRF 总 ATG16L1 和磷酸化 ATG16L1（Ser278）试剂盒

将人 U-87 MG 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 mTOR 抑制剂 AZD2014 的浓度梯度处理细胞 3 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25 µl 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 1 小时裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）或总 ATG16L1 检测试剂。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。如预期所示，强效 mTOR 抑制剂 AZD2014 会诱导自噬激活，导致 ATG16L1 的 Ser278 位点磷酸化呈剂量依赖性增加，而对总 ATG16L1 蛋白的表达水平无显著影响。

将人 U-87 MG 细胞以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 2.5 µM 的 mTOR 抑制剂 AZD2014 和自噬激酶 ULK1/2 抑制剂 ULK-101 的浓度梯度处理细胞 3 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25 µl 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 1 小时裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）或总 ATG16L1 检测试剂。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。如预期所示，强效双重自噬激酶 ULK1/2 抑制剂 ULK-101 会抑制 AZD2014 诱导的自噬激活，导致 ATG16L1 的 Ser278 位点磷酸化呈剂量依赖性降低，而对总 ATG16L1 蛋白的表达水平无显著影响。

2assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-2-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（验证示意图 2）
3assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-3-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（验证示意图 3）

利用 HAP1 ATG16 敲除细胞验证 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测的特异性

使用 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）试剂盒评估野生型（WT）和 ATG16 敲除（KO）HAP1 细胞中人磷酸化 ATG16L1（Ser278）的表达水平。将细胞系在培养瓶中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时。然后用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A（Calyculin A）处理细胞 10 分钟。移除培养基后，加入补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂。同时，使用 GAPDH 管家基因细胞检测试剂盒（# 64GAPDHPET/G/H）监测 GAPDH 水平：将 4 µL 细胞裂解物用 180 µL 11 号稀释剂预稀释，然后将 16 µL 稀释后的样品与 4 µL HTRF GAPDH 管家基因细胞检测试剂混合。室温孵育过夜后记录两种试剂盒的 HTRF 信号。在两种测试条件下，测得的 GAPDH 水平相当。相比之下，HAP1 野生型细胞中 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）信号显著为阳性，而 HAP1 ATG16 敲除细胞中该信号大幅降低（与阴性信号相当），这证明了 HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测对 ATG16L1 蛋白检测的特异性。HAP1 ATG16 敲除（10bp 缺失）细胞系来自 Horizon Discovery # HZGHC000296c010，HAP1 野生型细胞系来自 Horizon Discovery # C631。

4assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-specificity-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（特异性验证示意图）

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测在多物种细胞系中的通用性

将人（PC-3）、小鼠（C2C12）和大鼠（H4-II-E）细胞系以 100,000 个细胞 / 孔的密度接种到 96 孔板中，使用完全培养基，在 37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。用 2.5 µM 的 mTOR 抑制剂 AZD2014 处理细胞 3 小时（37°C、5% CO₂）。移除培养基后，加入 25 µL 补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 1 小时裂解细胞。细胞裂解后，将 16 µL 裂解物转移至 384 孔低体积白色微孔板中，再加入 4 µL HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂。室温孵育过夜后记录 HTRF 信号。HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测在测试的 3 个物种的细胞系中均显示出显著的阳性信号，这表明其能够检测人、小鼠和大鼠版本的该蛋白，适用于转化研究。

5assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-cross-reactivity-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（通用性验证示意图）

HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测试剂盒与蛋白质印迹法的比较

将 HCT116 细胞在培养瓶中培养，在 37°C、5% CO₂条件下孵育 48 小时。然后用 100 nM 的花萼海绵诱癌素 A 处理细胞 10 分钟。移除培养基后，加入补充的 3 号裂解缓冲液（1X）+ BR（2X），在室温下轻轻振荡 30 分钟裂解细胞。离心 10 分钟后收集可溶性上清液。取等量裂解物，采用蛋白质印迹法（WB）与 HTRF 进行平行比较。结果显示，HTRF 磷酸化 ATG16L1（Ser278）检测的灵敏度是蛋白质印迹法的 4 倍。

6assay-validation-phospho-ser278-atg16l1-wb-comparison-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（比较示意图）

简化通路

巨自噬中简化的 ATG16 信号通路

自噬是一种进化上保守的细胞过程，几乎存在于所有真核细胞中，从酵母到哺乳动物均有发现。自噬对维持体内平衡至关重要，参与多种生理过程，包括应激反应（如饥饿、缺氧、高温）、细胞生长和衰老。相反，自噬机制的功能障碍与癌症、神经退行性疾病、传染病以及心脏和代谢疾病等相关。自噬分为 3 种类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。巨自噬（以下简称自噬）始于从富含磷脂酰肌醇 3 - 磷酸的膜（如内质网、高尔基体或质膜）上形成芽体，即自噬前体结构（PAS）。这种杯状结构需要由 Atg13、Atg101、FIP200 和 ULK1 蛋白形成的 ULK1/Atg1 复合物。包含在囊泡中的跨膜蛋白 Atg9 参与将 Atg2-Atg18 募集至自噬前体结构。Atg2 蛋白凭借其磷脂转移活性，提供膜延伸所需的磷脂。ULK1 磷酸化并激活 Beclin1，Beclin1 与 Vsp15、Vsp34、Atg14 和 NRFB2/Atg38 结合形成 III 类磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3KC3 - 复合物 1）。该复合物会产生磷酸肌醇三磷酸（PIP3），进一步引导 PI3P 结合蛋白 Atg18/WIPI 1-4 和 Atg12-Atg5-Atg16 复合物的募集。后者与 Atg4 和 Atg7 一起参与吞噬泡上的 LC3B 脂化（从 LC3-I 向 LC3-II 转化），并有助于自噬体成熟，随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其中包裹的细胞成分被降解，其组成成分得以循环利用。

丝氨酸 278 位点磷酸化的 ATG16L1 仅存在于新形成的自噬体上，因此对其进行定量可作为自噬囊泡形成和自噬诱导的理想替代指标。重要的是，其水平不受长期应激或自噬晚期阻滞的影响，而这些因素可能会干扰自噬分析。此外，自噬激酶 ULK1 介导的 ATG16L1 磷酸化是自噬诱导的保守指标，可被多种刺激激活。综上所述，分析 ATG16L1 的磷酸化状态是研究自噬诱导的优良读数。

7phospho-pathway-atg16l1-64atg16s8peg-64atg16s8peh-64atg16s8pef.svg（通路示意图）

规格

其他规格

应用：细胞信号传导
品牌：HTRF
检测方式：HTRF
兼容的裂解缓冲液：1 号裂解缓冲液、2 号裂解缓冲液、3 号裂解缓冲液、4 号裂解缓冲液
分子修饰：磷酸化
产品类别：试剂盒
样品体积：16µL
运输条件：干冰运输
靶标类别：磷酸化蛋白
靶标物种：人类、小鼠
技术：时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）
单位规格：500 个检测点

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货号：64ATG16S8PEG

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